大电导钙激活钾通道功能调控机制的研究进展

朱 倩 (浙江海宁市人民医院 314400)

大电导钙激活钾通道(也称作BKCa，MaxiK或Slo-1)是钾离子通道家族重要的成员之一。它具有大单通道电导、分布广泛、受膜电位和胞内钙离子双重调控等特点，参与许多重要的生理活动。

BKCa通道是由四个形成孔道的α亚基聚集而成的对称复合物，在很多组织中由α亚基和β亚基组成，β亚基对通道的功能起调节作用。BKCa通道的α亚基的N端有7个跨膜区段(S0～6)，COOH端包含4个疏水区段(S7～10)，这一区段对通道的调节起着十分重要的作用。S7～8区段有两个钾电导调节区(RCK)，在S10区段前有一系列保守的带负电荷的天冬氨酸残基，是钙离子结合的位点，称为“钙池”。此外，在COOH端还有其他的一些调节位点，如四聚化位点、磷酸化位点、镁离子结合位点等。在不同组织中，BKCa通道的功能特征有显著的差异，其功能受很多机制所调控，本文就近年来在这方面的研究进展作一综述。

1 β亚基及其他辅助蛋白的调控

在哺乳动物中，已有4个β亚基（β1～β4）被克隆。尽管β亚基之间的同源性很高，但它们的表达谱及对BKCa通道功能特征的影响有显著的差异。β1主要在平滑肌、毛细胞和某些神经元中表达，通过改变亚基电压感受器的构象及其移动来减慢BKCa通道的门控，并增加通道对钙的敏感性[1]。此外，β1的共表达能改变钙离子对α亚基中两个主要钙结合位点的亲和力，当通道开放时，钙离子对RCK1的位点亲和力增加，而在关闭时，对“钙池”的亲和力则下降[2];β2则能加速BKCa通道的失活；β3在睾丸、胰腺和脾脏中表达，也能加速BKCa通道的失活，但不影响通道对钙的敏感性；β4在大脑中的表达最高，能减慢通道的失活，改变通道的钙依赖性电压－电导关系，并且能使BKCa通道对阻断剂IBTX和ChTX的敏感性下降。当β4亚基和α亚基共同形成通道时，通道口的静电作用及空间位阻可阻止ChTX的进入，从而使通道对阻断剂的敏感性下降。有研究显示，β4胞外区中四个连续的赖氨酸残基和BKCa通道中央孔道的胞外入口很近，它们组成三个带正电荷的环，能降低胞外钾离子浓度，以赋予BKCa通道的外向性整流特征[3]。Martin等[4]报道，β4能调节BKCa通道对酒精的反应，当α亚基和β4亚基在HEK293中共表达时，BKCa通道对酒精的急性耐受性会显著下降；从β4亚基敲除的小鼠中分离的神经元中的BKCa通道对酒精能产生快速耐受性，因此β4亚基有可能成为治疗酒精中毒的一个靶点。

除了上述4个β亚基外，其他一些辅助蛋白也能调控BKCa通道。研究者用酵母双杂交的方法在果蝇中鉴定了两个BKCa的调节蛋白Slob和dSLIP1。dSLIP1能减少BKCa通道在细胞膜上的表达，而降低BKCa通道的电流幅度；Slob本身对BKCa通道只有较弱的作用，但当它与另一种称作14-3-3的蛋白共同作用时，可以显著地抑制BKCa通道的活性。一种Mink相关肽MiRP3也可以调节BKCa通道，在CHO细胞中它可显著减小BKCa通道的电流密度，并使通道的电压－电导的关系曲线向更去极化的膜电位偏移[5]。在肾脏足细胞中，nephrin蛋白可调节BKCa通道的表面表达[6]。此外，BKCa通道的表面表达也受一种称作MAGI-1的膜支架蛋白抑制，MAGI-1可能在肾脏及大脑等组织中调节BKCa通道的活性。大多数关于β亚基及辅助蛋白对BKCa通道的研究结果来自于离体的异源表达系统，且近年来的研究还发现BKCa通道的某些β亚基及辅助蛋白对其他的钾离子通道也有调节作用。因此，β亚基及辅助蛋白对BKCa通道在体内调节作用的特异性仍有待于进一步验证。

2 磷酸化调控

在神经、肌肉及非兴奋性细胞中，离子通道功能结构的多样性是电信号变化的基础，蛋白磷酸化是产生这种多样性的重要机制之一。许多离子通道的内在门控特征受细胞中磷酸激酶和磷酸酶的调控，这些酶可以通过修饰通道蛋白中某些特定的可逆性磷酸化位点来动态调节通道的活性。BKCa通道是各种常见的丝氨酸/苏氨酸激酶的重要底物之一，这些酶包括cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA), cGMP依赖性蛋白激酶G(PKG)以及二酰基甘油/Ca2+依赖性蛋白激酶C(PKC)等。这些激酶可使BKCa通道的活性与细胞的各种信号级联反应相关联，以控制细胞的兴奋性或收缩性。Tian等[7]报道，哺乳动物BKCa通道α亚基的所有剪接体都含有一个保守的PKA位点，此位点位于C端“钙池”序列附近，通道所有4个亚基在该位点的磷酸化可使其活性提高60%。Yan等的研究[8]显示，BKCa有至少7个选择性剪接体，他们鉴定了多达30个的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点，且通过在HEK293细胞中的电生理实验，证实了BKCa通道α亚基的磷酸化能差异性地调节通道的电压和钙的敏感性，提示BKCa通道α亚基的动态磷酸化修饰可能为哺乳动物中枢神经系统中神经元的兴奋性的控制提供一种分子机制。

BKCa通道的活性也可受Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的调控，在用秀丽线虫为模式动物的一项研究中发现，在神经肌肉接头的突触前膜中，CaMKⅡ能通过直接磷酸化线虫BKCa通道的苏氨酸残基T425调节其功能，进而控制神经递质的释放[9]。Liu等[10]报道，CaMKⅡ能通过磷酸化N端的T107抑制牛BKCa通道的活性，并改变通道对酒精的敏感性。在中枢神经中，CaMKⅡ被认为是记忆和学习过程中的关键分子，它对BKCa通道的作用提示了BKCa通道可能参与神经元可塑性的调节。

除了α亚基，通过β亚基或其他辅助蛋白的磷酸化也能调节通道的功能。有研究指出，当BKCa通道在HEK293细胞中表达时，其活性与内源性的酪氨酸激酶和磷酸酶密切相关，而这种相关性依赖于通道的接头蛋白cortictin的可逆性磷酸化，表明BKCa通道的活性受cortictin磷酸化状态的调节[11]。

3 mRNA 选择性剪接的调控

在不同物种中，BKCa通道的α亚基都有很多的选择性剪接体，其中有些能产生具有显著钙敏感性及动力学差异的通道，以行使不同的生物学功能[12]。在耳蜗的毛细胞中，不同剪接体编码的通道能在毛细胞的基膜形成一种钾电流的梯度，调节毛细胞中电压共振的频率。这些通道在动力学上有显著的不同，它们与电压门控的钙通道的组合，在很大程度上决定了毛细胞的电学调谐。在小鼠的发育过程中，中枢神经系统中BKCa通道的不同剪接体的丰度有很大变化，说明哺乳动物在大脑发育过程中，需要具有不同特征的BKCa通道来行使功能。Soom等[13]报道了在原始的大脑组织中，BKCa通道中编码S6至RCK1区段的外显子可以被一个同样大小的外显子取代，而通道的门控特征也发生了变化，在低钙时通道能被更快激活，而在高钙时其开放频率增加。

外显子选择性的剪接还能作为一种分子开关来决定该通道的磷酸化调控的特性。研究显示，PKA能通过磷酸化保守的S869而激活通道，但如果通道中包含外显子STREX时，又能通过磷酸化其中的一个残基来抑制其活性。因此，外显子STREX成了BKCa通道在PKA激活型和PKA抑制型之间转换的分子开关，这种外显子选择性剪接和磷酸化修饰的组合大大丰富了BKCa通道活性的调控模式[14]。

过去十几年的研究已确立了BKCa通道在生物体对酒精耐受性的产生中起重要的作用[15]。例如在视上核及纹状体中，BKCa通道对酒精的敏感性会逐渐下降。有研究发现[16]，BKCa通道对酒精敏感性下降是由一种含有称作ALCOREX外显子的mRNA的选择性降解所引起的，这种ALCOREX mRNA的选择性降解提高了其他剪接体的相对比例，使形成的通道对酒精不敏感；mRNA的选择性降解是由microRNA miR-9所介导，在ALCOREX mRNA的3，-UTR中含有miR-9的识别序列，酒精可以使miR-9的丰度上调，从而使ALCOREX mRNA得以选择性的降解。mRNA选择性剪接的调控在很大程度上丰富了BKCa通道的生物学功能。

4 内源性代谢物的调控

近年的研究指出，BKCa通道的功能可被许多内源性代谢物调节，其中包括氧化亚氮(NO)、一氧化碳(CO)等气体信号分子，4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、血红素等。例如，在海马CA1锥体神经元中，慢性间歇性组织缺氧可显著降低BKCa通道的开放频率，这种BKCa通道的活性下降是由NO的不足引起，表明NO的缺失可抑制BK的活性[17]。在培养的人脐血管内皮细胞中，CO可直接或通过NO及cGMP依赖性途径激活BKCa通道。在HEK293细胞中，CO能可逆性地作用于BKCa通道的S9-S10区段，以浓度依赖性方式快速激活BKCa通道，但不影响通道的单通道电导和去激活[18]。PIP2能直接调节BKCa通道的功能，通过增加钙驱动的门控过程并改变通道开关，但不影响通道的单通道特征和电压依赖性，这种作用能被β1亚基显著加强[19]。血红素能结合BKCa通道，抑制其活性。氧化型及还原型的血红素都能直接与BKCa通道结合，降低通道的开放频率。后来的研究发现，血红素是CO作用于BK通道的受体，CO能结合还原型血红素，使其由通道抑制剂转变成激活剂，这揭示了气体信号分子调节离子通道的一种新机制[20]。在气管平滑肌细胞中，白细胞介素IL-4能通过快速增加近膜钙离子的浓度来调节BKCa通道的功能[21]。此外，在血管平滑肌中，BKCa通道能被前列腺素、过氧化氢及脂质加氧酶产物等内源性代谢物所激活，从而使血管平滑肌超极化而舒张[22]。以上这些研究揭示了内源性代谢物对BKCa通道调节作用，为寻找新的治疗心血管疾病的药物提供了分子基础。

5 其他调控机制

BKCa通道蛋白中含大量对很多氧化剂敏感的半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)残基。半胱氨酸特异性还原剂二硫苏糖醇(DTT)能加快BKCa通道激活的动力学过程，增加单通道开放概率。过氧化氢等氧化剂可选择性地氧化半胱氨酸残基，抑制BKCa通道的钙依赖性激活，这种抑制性效应部分由C末端911位的半胱氨酸残基氧化所介导。除了C911外，对RCK区段C430的氧化修饰也能改变BK通道的钙依赖性激活。Zhang等报道[23]，BKCa通道的C430和C911残基与撕裂膜片中通道的时间依赖性衰减有关，而给予还原剂DTT可以阻止这种衰减。此外，RCK区段中三个蛋氨酸残基(M536、M712和M739)的氧化能增加BKCa通道的活性[24]。

某些离子通道也能调节BKCa通道的活性。在血管平滑肌细胞中，瞬时受体电势(TRP)通道TRPV4能与BKCa通道及ryanodine受体形成钙信号复合体，通过钙诱导的内钙释放以引起平滑肌细胞的超极化和血管舒张。在培养的人支气管内皮细胞系中，TRPV4与BKCa通道的功能相耦合，钙离子通过TRPV4激活BKCa通道[25]。在肾脏足细胞中，BKCa通道能与内源性TRPC3和TRPC6结合，在HEK293细胞中共表达时，TRPC6能增加BKCa通道的表面表达及电流幅度，提示TRPC通道可能作为激活BKCa通道的钙源之一来调节其活性[26]。在血管平滑肌细胞中，TRPC1能与BKCa通道结合，通过TRPC1的钙离子可激活BKCa通道而引起细胞膜超极化[27]。上述研究表明，在平滑肌细胞中，TRP通道的存在为BKCa通道的功能调节提供了一种新的机制。

6 结语

BKCa通道的独特之处在于一方面它对钾离子的高通透性，另一方面它结合了电压门控和配体门控离子通道的功能结构特点，因而可以受很多因素的调控。BKCa通道广泛表达于神经元、平滑肌、内分泌等组织器官中，对细胞中各种信号的整合、细胞兴奋性的控制、细胞内钙离子的动态平衡等方面起重要的作用。BKCa通道的缺失能导致神经系统、心血管系统、呼吸系统的多种疾病，包括癫痫、运动障碍、听力损伤、高血压疾病、哮喘等。近年来，科学家们利用分子生物学、遗传学、生理学等实验方法，发现了更多的组织特异性BKCa通道α亚基形式及一些新的辅助蛋白，有关BKCa通道功能的调控机制正在被进一步揭示。这些研究将对寻找新的药物靶点和治疗相关疾病提供重要的理论依据。