抗体介导的排斥反应与临床

蔡俊超

【编者按:本文根据蔡俊超教授在2010年中华医学会泌尿外科学分会肾移植全国高峰论坛暨全国移植免疫高级研讨班上授课内容整理。】

关于器官移植排斥反应目前主要有两个理论，即细胞学理论和抗体理论。伦敦国王大学的Peter Gorer最早提出抗体是引起排斥反应的主要介质，而牛津大学的Peter Medawar最早提出T细胞是介导移植器官免疫排斥反应的主要介质，他也因在器官移植免疫耐受方面的成就获得1960年诺贝尔生理学或医学奖。从20世纪50年代到21世纪以前，大量的实验和临床研究的结果都支持细胞免疫介导了移植器官的排斥反应，而且临床上我们应用的免疫抑制剂如他克莫司、环孢素等，在作用机制上也主要特异性针对T细胞。由于Peter Gorer的早逝，抗体在器官移植排斥反应中的作用并没有引起广泛关注。从20世纪80年代开始，特别是进入21世纪后，由于各种检测技术的发展，大量关于抗体和移植物排斥反应相关研究问世，最近10年来，抗体介导的排斥反应(antibody mediated rejection，AMR)的理论越来越受到重视。

1 AMR组织学诊断

最经典的、国际上广泛采用的AMR病理学诊断标准是Banff标准。1991年在加拿大Banff召开了第1次关于器官移植特别是肾移植排斥反应病理学诊断标准的国际会议，讨论了如何从病理学上诊断急性或慢性、抗体或细胞免疫引起的排斥反应。但是此次会议并没有在诊断标准上形成广泛共识。以后每两年在Banff召开会议对制定的标准进行讨论修缮，直到1997年，第4届Banff会议制定的移植肾排斥反应诊断标准被大部分的病理实验室采用。Banff 97标准将AMR分为超急性AMR和加速性急性AMR两类。当时认为这两种AMR都是偏向于较早期的排斥反应。接着，2001年的Banff会议提出了C4d理论。C4d是抗体激活补体后所产生的补体片段，会沉积在肾小管间质毛细血管内皮细胞表面，可以用免疫荧光的方法检测。C4d沉积是诊断体液性排斥反应的标志，这一诊断标准的纳入为诊断AMR找到了病理学方面的客观证据。Banff 05标准首次将抗体介导的慢性排斥反应列入其中，由此AMR重新分为急性和慢性活动性两类，而且规定AMR的诊断除了需要C4d沉积证据外，还需检测到供者特异性抗体(donor-specific antibody)。Banff 05标准同时提出根据染色后C4d的弥散范围即局灶性或弥散性来判断由抗体介导的急性或慢性排斥反应的程度。在发现C4d沉积和检测到抗体的情况下，AMR患者在组织形态学上可以没有变化。因此，在最新的Banff 07标准中，AMR诊断进一步细分，将只有这些危险因子存在而没有发生病理形态学变化的情况作为一类早期排斥反应。细分AMR诊断标准的意义在于临床医生或临床病理学界已经认识到抗体引起的排斥反应的重要性。

2 AMR抗体检测技术

最早应用于AMR检测抗体是交叉配型方法，这种方法需要供者的细胞。供者的淋巴细胞表面有供者特异性抗原，然后与受者血清反应。受者血清当中可能存在抗供者的抗体，这些抗体与供者的淋巴细胞反应，特异性抗体结合到细胞表面，在补体存在的情况下，激活补体可将细胞溶解。因为它是在微小的板上进行的，这种方法又称为微淋巴细胞毒试验(micro-lymphocyte toxicity test)，从机制上称为补体依赖细胞毒作用(complement dependent toxicity，CDC)。对接受尸体供肾受者而言，没有供者的细胞，则采用群体反应性抗体(penel reactive antibody，PRA)检测方法。《新英格兰医学杂志》曾报道，用交叉配型和PRA两种方法检测抗体均阳性的情况下，超急性排斥反应发生的概率为80%;在PRA阳性交叉配型阴性的情况下超急性排斥反应发生的概率是15%;两者均阴性的情况下排斥反应发生的概率是2.4%［1］。这项研究结果发布以后，20世纪70年代初这两种检测方法便逐渐被器官移植界所采用，几乎所有的患者都用PRA或交叉配型的方法来检测抗体情况，以预测会不会发生排斥反应。这两种方法在应用一段时间后，人们又发现另外一个问题，即有部分患者在PRA和交叉配型均阴性的情况下，随访一段时间后也发生了排斥反应，人们开始怀疑这两种方法的敏感性。人的抗淋巴细胞抗体是人免疫球蛋白，在检测过程当中加入抗人球蛋白抗体作为二抗，可起到相互联结的作用，使更多的补体被激活，基于此，有人设计了另外的实验方法，在原来的PRA方法基础上加入二抗来提高检测敏感度。到20世纪80年代，流式细胞分析方法被应用于交叉配型，称为流式细胞交叉配型，即用受者血清与供者的细胞产生反应。反应后不是用淋巴细胞毒的方法来判断结果，而是采用尾部带有荧光标记的抗体作为检测标志。如果有一抗存在，尾部有荧光标记的二抗也会结合上去，再用流式细胞法判断体内是否存在结合了抗体的供者细胞。

综上所述，以细胞为基础的检测抗体的方法在有供者细胞的情况下用CDC交叉配型，在没有供者细胞存在的情况下用人群的细胞行PRA检测。

到20世纪90年代，随着分子生物学和蛋白生物化学的研究进展，可以直接用纯化抗原来检测抗体，如ELISA、流式细胞分析、Luminex等方法。这些方法的试验原理基本相同，关键还是需要纯化的抗原。近2年来，Luminex方法逐步替代流式细胞分析，它的优势在于其内部标记荧光微珠的数量可以达到100，也就是说它可以同时检测出超过100个不同抗原特异性的抗体，检测时间和费用都大大下降。

比较上述以细胞为基础的和以抗原为基础的两类检测方法，可以看出前者较后者敏感性弱，这是因为细胞表面特异性的抗原如HLA、主要组织相容复合物Ⅰ类链相关基因A(major histocompatibility complex classⅠ chain-related gene A，MICA)等的量要远远低于人为纯化出来包被到微珠上的抗原量。在以细胞为基础的各种检测方法中，CDC方法的敏感度要低于流式细胞交叉配型，因为CDC是一个功能性的方法，它只检测有细胞毒的抗体，而流式细胞法只检测抗体是否结合，它既包括有细胞毒的抗体，也包括没有细胞毒的抗体。以抗原为基础的各种检测方法中，单一抗原(即一个微珠表面包被一个抗原)的敏感度远远高于混合抗原(一个微珠表面包被混合抗原)。从靶抗原特异性而言，交叉配型以供者细胞为基础，靶抗原特异性很强，其抗体直接针对供者特异性抗原。而PRA是针对整个人群，靶抗原特异性相对要弱。单一抗原包括了供者特异性抗原，其针对某一靶抗原特异性高，而混合抗原检测出来的是混合抗体，无法具体识别是针对哪一特定靶抗原。对靶抗原以细胞为基础的检测方法较以抗原为基础的检测方法有优势，前者的靶抗原有可能包括了HLA和MICA，以及一些未知的目前还无法确定的抗原;而以抗原为基础的检测方法，靶抗原是人工纯化的抗原，特异性更高。以细胞为基础的检测方法，可以是功能性的如CDC方法，也可以不是功能性的如流式细胞交叉配型;而以抗原为基础的检测方法主要是看抗原抗体结合能力。以细胞为基础的检测方法直接以细胞为原料，受到的干扰可能较少;而以抗原为基础的检测方法，受到的干扰可能较多，如部分抗原发生变性后导致交叉反应。

3 抗体与排斥反应关系的临床证据

现有证据表明，抗移植物抗体可能引起移植物功能丧失。

交叉配型和PRA两种方法检测抗体都是阳性的受者，超急性排斥反应的概率明显高于抗体阴性的受者［1］。PRA＜10%、10% ～80%、＞80%的受者发生超急性排斥反应的概率分别为6%、16%和30%，发生原发性移植物无功能的概率分别为16%、24%和41%，高PRA受者明显高于低PRA受者。关于PRA引起的急性排斥反应，1987年有学者用流式细胞PRA检测，PRA阳性受者1个月后有33%发生了排斥反应，明显高于PRA阴性受者的8%［2］。另一位学者用同样的方法检测，结果 PRA阳性者急性排斥反应发生率是20%，而PRA阴性者为7%［3］。最后一个证据是关于抗体引起的慢性排斥反应。美国器官分配联合网络数据库的数据显示，1995—2000年尸体肾移植移植物存活率随时间呈直线下降，10年移植物存活率肾、心脏和肝分别为42%、52%和53%，慢性排斥反应导致的移植物功能的丧失在过去40年以来并没有很好改善，平均每年有5%受者逐步丧失移植物功能，也就是说，今年移植的所有受者在20年后几乎都要重新移植或者会面临死亡。

从2002年开始有一个关于抗体和排斥反应相关关系的国际合作课题招募了近2000例患者，这些患者的移植物在当时均“功能尚好”，或者肌酐水平在1.0 ～ 1.2 mg/dL(88.4 ～ 106.1 mol/L)以下。收集他们的血清做抗体筛选，其中80%的患者抗体阴性，20%抗体阳性。随访3年，观察每年移植物功能情况，抗体阴性者中2.9%发生移植物功能丧失，而抗体阳性者的失功率为8.7%，两者间差异有统计学意义［4］。2年后，抗体阴性者6.8%发生了排斥反应，抗体阳性者15.1%发生排斥反应，两者间差异也有统计学意义［5］。3年后，抗体阴性者有8.1%发生了排斥反应，而抗体阳性者高达24.5%发生排斥反应，两者也有显著的差异［6］。

这些证据表明抗体阳性会使排斥反应发生概率增高。既然抗体会引起排斥反应，那抗体应该出现在发生排斥反应之前，也就是在移植物功能发生变化之前就应该能检测到抗体。有学者曾报道其随访的1例受者移植后不同时间检测抗体和血清肌酐水平结果:两者在移植后早期均维持稳定，而至60～70个月时抗体水平突然明显上升，从这时开始供者特异性抗体从阴性转变为阳性，而肌酐仍维持在之前的正常水平，因此没有采取相应的临床措施，最后导致肌酐发生了不可逆转的上升;另1例患者也有类似的情况。若把患者分为两组，一组为发生排斥反应受者，另一组为未发生排斥反应受者，排斥反应组很多在移植后早期就出现了抗体，到最后发生了移植物失功。而无排斥反应组大多抗体阴性，部分为弱阳性，少数为强阳性［7］。为进一步证实结果，我们开展了另一项国际合作课题，研究对象包含了近2000例不同器官移植受者。结果与前类似，肾移植抗HLA抗体阳性者在跟踪随访4年后，移植肾存活率显著低于抗HLA抗体阴性者。心脏移植、肺移植受者也类似，而肝移植受者中这种差异却不甚显著，是否与肝作为免疫特惠器官有关?

4 AMR机制

抗体引起移植器官排斥反应首先需要抗原抗体结合，最早的结合部位是血管内皮细胞。抗原抗体结合后有4个通路可以引起内皮细胞损伤。前3条通路与补体相关。第2条通路中补体被激活后，发生C4d沉积，同时，补体激活之后产生的片段可以吸引很多炎症细胞到组织器官，移植物的慢性排斥反应也属于炎症过程。带有补体受体的细胞，主要是单核细胞和中性粒细胞，补体与这些细胞上的补体受体结合之后引起细胞的吞噬作用，也可能造成内皮细胞的损伤。第4条通路与补体无关，我们称之为抗体依赖的细胞毒作用(antibody-dependent cytotoxicity)，它不需要补体的参与，而是在抗体结合到内皮细胞之后，由带有能结合抗体的Fc受体的吞噬细胞或NK细胞、单核细胞或中性粒细胞与抗体结合，可能对靶细胞产生杀伤作用。所有这些通路，最终都会导致内皮细胞的损伤，这些损伤称为原发性损伤。在此基础上，由内皮细胞损伤所导致的进一步损伤称为继发性损伤。继发性损伤包括:(1)内皮细胞损伤后基底膜暴露，进一步激活血小板并导致微血栓形成，这一机制是超急性排斥反应和急性排斥反应发生的主要机制，最后会导致血管闭塞;(2)内皮细胞损伤之后，血管平滑肌会暴露在抗体、其他细胞因子或其他细胞之下，平滑肌细胞受损之后会更新复制，这一过程也可能对血管造成影响;(3)原来的内皮细胞在损伤之后产生新的内皮细胞进行补充，但是在内皮细胞复制修复过程不可控制地也可能会对组织器官造成损害;(4)内皮细胞损伤之后，可能使体内的一些体液因子或细胞因子直接进入细胞间质，对其他一些非血管组织如肾小球、肾小管产生直接影响。前3种机制导致血管病变、狭窄和堵塞以及组织缺血等可引起组织结构功能改变，最终丧失功能。

综上所述，在抗体引起排斥反应过程中，首先要产生抗体，其次是在临床检测或病理检测中发现C4d沉积，在此基础上进一步组织损伤，最后导致移植器官功能性指标如血清肌酐等上升。因此临床见到血清肌酐水平发生变化的时候，也就是移植肾发生功能损害的时候，已经相对较晚了。

5 AMR的预防和治疗

预防和治疗体液性排斥反应，主要包括以下措施:(1)去除体内的抗体;(2)抑制和(或)去除产生抗体的细胞，这是最根本的治疗方法，也是最终解决问题的方法;(3)对症治疗，延迟抗体导致的组织器官原发性或继发性损伤;(4)其他措施，包括抑制补体功能、抑制机体固有免疫功能或T细胞免疫功能等。

5.1 去除或抑制体内的抗体

血浆置换是将患者血浆当中存在的抗体滤过后再回输血浆，这一过程也可以将补体等成分一起去除。免疫吸附方法最早应用于ABO血型不匹配移植受者，但是目前尚无商品化的能在移植前特异性吸附HLA抗体的产品，而且因为技术原因以及吸附程度的不确定，这一方法在国际上并没有广泛应用，但这不失为一种值得考虑的方法。静脉输注免疫球蛋白包含了来源于成千上万不同人的抗体成分，可能会特异性地阻断抗移植物特异性抗体结合抗原的部位，也可能会阻断移植物抗原上结合宿主抗体的部位。有研究认为静脉输注免疫球蛋白有抑制补体激活的功能，可能通过阻断或下调Fc受体的功能来发挥作用，当然可能还有其他机制存在。

5.2 抑制或去除产生抗体的细胞

这类措施包括以下:(1)脾是B细胞产生的主要器官，脾切除后可以去除大量的B细胞，对受者接受移植物有很大的帮助。2000年初日本东京大学的研究者开始对ABO血型不匹配的移植受者实施脾切除术。因为日本的移植器官来源非常紧缺，即使亲属供者ABO血型不匹配也会实施移植手术，而ABO血型不匹配导致的排斥反应甚至超过HLA不匹配引起的排斥反应。(2)T细胞免疫抑制剂，包括环孢素、他克莫司、雷帕霉素等，因为B细胞产生抗体依赖于T细胞帮助，这些药物也间接抑制了B细胞产生抗体。(3)辅助免疫抑制，主要指吗替麦考酚酯，少数为硫唑嘌呤，其作用直接针对分裂细胞，对T细胞、B细胞都有抑制功能，相对环孢素、他克莫司、雷帕霉素等药物而言，吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤对产生抗体的B细胞的作用更直接、更有效。(4)特异性针对淋巴细胞的单克隆抗体或多克隆抗体，较早期应用的如抗淋巴细胞球蛋白、抗CD3+T淋巴细胞单克隆抗体(basiliximab)，现在逐渐被抗胸腺细胞球蛋白、抗CD52单克隆抗体(alemtuzumab)所取代。近几年来，抗CD20单克隆抗体(rituximab)的应用越来越多。CD20是B细胞表面的主要标志，抗CD20单克隆抗体对B细胞有杀伤或抑制作用。以上(2)～(4)点所提到的治疗方法都是直接或间接作用于B细胞，从而控制体液免疫导致的排斥反应。(5)硼替佐米(bortezomib)是一种蛋白酶抑制剂，其作用机制是抑制蛋白酶，阻断核因子-κB介导的信号传导通路，诱导所有分裂细胞主要是浆细胞死亡。硼替佐米最早用于治疗多发性骨髓瘤，基于多发性骨髓瘤主要是浆细胞来源的肿瘤，而抗体主要产生于浆细胞的认识，将硼替佐米应用于器官移植领域。我们中心组织的一项由30～40个中心参与的国际合作项目应用硼替佐米结合血浆置换治疗体内存在抗体的患者，在应用了几个剂量之后，抗体水平回落到阴性或弱阳性。

5.3 对症治疗

(1)抗凝治疗。在急性排斥反应期血栓形成是排斥反应发生的主要机制之一，抗凝治疗在这个阶段可以很快逆转超急性排斥反应。(2)激素冲击治疗。尽管不断有新的免疫抑制剂问世，但是糖皮质激素仍是一线免疫抑制剂，目前仍有90%以上患者在使用类固醇激素，它对B细胞也有直接的杀伤作用。(3)阻断补体激活通路的抗C5单克隆抗体(eculizumab)，它通过阻断C5的裂解，抑制由抗体引起的CDC，从而用于抗急性排斥反应。这一作用的结果是阻断了补体的激活通路，但是抗体仍在体内存在。有学者将eculizumab用于因灾难性抗磷脂抗体综合征而行肾移植的患者，患者移植前给1次高剂量(1200 mg)，移植后 1、6、9、14 d 分别给予低剂量(900 mg)，在21、35 d再给予高剂量，使其血药浓度在体内呈一个波动过程［8］。体外实验也表明，开始时溶血指标较明显，用eculizumab之后溶血指标几乎为零，从而使溶血得到很好的控制。该例受者移植后肌酐水平稳定在1.0 mg/dL(88.4 mol/L)左右。

前面所提到的一些治疗措施，是针对临床上发现这些患者已经有排斥反应，功能已经发生改变的情况下所采取的相应治疗。而如果在移植后跟踪观察，在患者临床功能指标没有发生改变或没有任何临床症状的情况下，检测抗体出现阳性的结果，说明这些患者的免疫功能没有得到有效控制，提醒临床医生要很关注这部分患者，因为他们很可能在出现抗体一段时间(平均11个月)之后，有的在1个月之内，有的会持续10多年以后发生排斥反应。机体内抗体水平因免疫抑制剂使用情况和患者体质而发生变化。若抗体检测结果为阴性，说明免疫抑制剂很有效，很好地控制了产生抗体的浆细胞或B细胞。对这些患者，如果我们调整免疫抑制剂，有些受者抗体会逐渐出现，因为这些患者不产生抗体的原因很可能是免疫抑制剂的作用;但是同时另外一些受者可能永远不会产生抗体，因为供者的抗原对这些患者来说免疫性不够强大，或者已经诱导了免疫耐受。对后一类患者，我们适当调整免疫抑制剂，甚至会发现所谓的“免疫无能(anergy)”，或者称为“免疫耐受”，这是一个很好的指征，即检测到阴性结果，可以针对患者的情况相应调整免疫抑制剂，即所谓的个体化治疗。导致过去40年来器官移植受者的生存情况没有得到改善的原因之一是移植后临床医生对移植受者所采取的治疗方案有“惰性”，总是按照国际上或国内的标准三联治疗，而不是有针对性地采取个体化治疗。现在美国非常强调针对不同患者个体化使用免疫抑制剂，而抗体的监测可为个体化治疗提供指导。

总之，抗体是引起慢性排斥反应的主要原因，监测抗体非常重要，最近几年来有新的方法对抗体引起的排斥反应进行预防或治疗。所有移植临床医生应高度关注并认识到抗体在排斥反应中的作用，对出现的情况及时作出相应的处理和治疗调整，这样才能很好地控制患者的情况，有助于改善移植器官的长期存活。

1 Patel R，Terasaki PI.Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation［J］.N Engl J Med，1969，280(14):735-739.

2 Cook DJ，Terasaki PI，Iwaki Y，et al.The flow cytometry crossmatch in kidney transplantation［J］.Clin Transpl，1987:409-414.

3 Ogura K，Terasaki PI，Johnson C，et al.The significance of a positive flow cytometry crossmatch test in primary kidney transplantation［J］.Transplantation，1993，56(2):294-298.

4 Terasaki PI，Ozawa M.Predicting kidney graft failure by HLA antibodies:a prospective trial［J］.Am J Transplant，2004，4(3):438-443.

5 Terasaki PI，Ozawa M.Predictive value of HLA antibodies and serum creatinine in chronic rejection:results of a 2-year prospective trial［J］.Transplantation，2005，80(9):1194-1197.

6 Terasaki PI，Ozawa M，Castro R.Four-year follow-up of a prospective trial of HLA and MICA antibodies on kidney graft survival［J］.Am J Transplant，2007，7(2):408-415.

7 Lee PC，Zhu L，Terasaki PI，et al.HLA-specific antibodies developed in the first year posttransplant are predictive of chronic rejection and renal graft loss［J］.Transplantation，2009，88(4):568-574.

8 Lonze BE，Singel AL，Montgomery RA.Eculizumab and renal transplantation in a patient with CAP［J］.N Engl J Med，2010，362(18):1744-1745.