微乳薄层色谱分离鉴别百叶消炎洗剂主要成分

郎轶咏， 王 强， 朱晓红， 刘兰娣， 姜同英

(1.中国人民解放军第二0二医院药剂科，辽宁沈阳1100032;2.沈阳药科大学药学院，沈阳110015)

百叶消炎洗剂为中国人民解放军第二〇二医院院内制剂，具有清热解毒，祛风燥湿，杀虫止痒的功效。用于妇女阴道炎，附件炎，赤带白下，淋病，尖锐湿疣等男女生殖器官疾病及痔疮，脚气等症状。百叶消炎洗剂由败酱草，土茯苓，苦参，夏枯草，蛇床子等十多味中药经过提取加工制成，成分复杂，分离比较困难，至今还没有统一的鉴别标准。中药成分的鉴别常采用TLC法，经典TLC法鉴别时展开剂常为多种有机溶剂，样品的前处理也比较繁琐，为了简化鉴别步骤，节省鉴别时间，笔者以含微乳液作为展开剂，聚酰胺薄膜为固定相，研究了百叶消炎洗剂的微乳薄层色谱行为，建立了微乳薄层色谱(ME－TLC)鉴别百叶消炎洗剂的有效成分(夏枯草、败酱草、蛇床子)，取得了满意的结果［1］。

1 仪器与试药

2F－1三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司);层析用聚酰胺薄膜(规格8 cm×20 cm，浙江省台州是路桥四甲生化塑料厂)。百叶消炎洗剂(解放军第202医院，批号:20080824);对照药材:败酱草，夏枯草，蛇床子，由202医院制剂室提供;十二烷基硫酸钠(SDS)(湖南尔康制药有限公司);其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 微乳层析液的制备

取SDS，精密称定，溶解于适量水中，加入油相、助表面活性剂，加水至足量，磁力恒温搅拌混匀，放置24 h即得澄清透明的微乳液。将各种改性剂加至组成不同的微乳液中，即得组成不同的微乳层析液。

2.2 供试品溶液的制备

取百叶消炎洗剂50 mL，加入95%乙醇醇沉2次，过滤，浓缩作为供试品溶液。

2.3 对照药材溶液的制备

分别取败酱草、夏枯草、蛇床子、对照药材适量，加水浸泡24 h后，加热至煮沸后在60℃ 条件下加热煎煮3 h，收集煎出液，过滤，加与水煎液等体积的95%乙醇醇沉2次，放置0.5 h，滤过，合并滤液，浓缩，作为对照药材溶液。

2.4 阴性对照溶液的配制

按处方比例及工艺，分别制备败酱草，夏枯草，蛇床子阴性对照溶液。

2.5 微乳薄层色谱

分别吸取败酱草、夏枯草、蛇床子的对照药材溶液、阴性对照液及百叶消炎洗剂的供试品溶液各2 μL，点于聚酰胺薄膜，直径为1～2 mm。以微乳层析液为展开剂，上行法展开，展程约11 cm，取出晾干后，置紫外光(365 nm)下检视，对照品溶液与供试品溶液在相同位置显现相同颜色的荧光斑点。

3 结果

3.1 微乳展开体系的选择

3.1.1 微乳展开剂含水量对展开效果及时间的影响

在保证SDS－正丁醇－正庚烷比例为0.27 ∶0.63 ∶0.10(w/w)的条件下，配制系列含水量不同的微乳液展开剂。以微乳液－甲酸－丙酮(4∶1∶1)为展开剂进行微乳薄层层析，测定含水量对百叶消炎洗剂主要成分斑点迁移的影响，以及其在不同含水量的微乳液中层析10 cm距离所需要的时间。结果见图1，2。

百叶消炎洗中的败酱草、夏枯草、蛇床子斑点的Rf值随着微乳液含水量增加而逐渐降低(见图1)。微乳液的含水量对层析时间有显著的影响，含水量越低，层析10 cm距离所需的时间越长。含水量在15% ～75%之间时(见图2)，3种主要成分相互之间的△Rf值随着微乳液含水量的增加而显著变大，且当水分含量为75%时达到最大值;当含水量大于75%时，△Rf随着微乳液含水量的增加而降低。当水分含量小于30%时，微乳类型为W/O型，各主要成分相互间的△Rf值较小，尤其是败酱草和蛇床子的斑点有部分重叠且不规则，没能彻底分离，分离效果不理想，且展开时间较长(＞6 h)。在W/O～O/W型(含水量45% ～60%)微乳液中，展开时间缩短，分离效果虽然得到改善，斑点基本都能分离，但斑点仍有扩散现象，且个别△Rf值略有降低，分离效果不够理想。在O/W型(含水量＞75%)微乳液中，分离效果得到显著的改善，但当含水量过大，大于90%，由于展开剂极性太大，薄层前沿分层明显，斑点略有拖尾现象，且分离度也降低。因此结合斑点效果和分离度以及时间等因素综合考虑，选择含水量75%的O/W型微乳液作为展开剂最为适宜。

图1 百叶各主要成分Rf值、时间与含水量的关系图

图2 百叶主要各成分△Rf与含水量的关系

3.1.2 油相对展开效果的影响

保证微乳液(含水量75%，其它同3.1.1项组成)组分不变的情况下，改变油相的种类，分别考察了正戊烷、正己烷、正庚烷和正辛烷4种油相对展开效果的影响。见表1。

表1 百叶各主要成分Rf值与油相种类的关系

败酱草、夏枯草和蛇床子的Rf值随油相碳连数增加而逐渐减小。可解释为:大分子油相不易嵌入表面活性剂中，而小分子油相可以像助表面活性剂一样容易嵌入表面活性剂中形成界面膜，即油相分子体积越小，对药物的溶解力越强，因此，为了增加药物的溶解度，增大微乳形成的区域，应该选择短链油相。当百叶薄层色谱中使用正辛烷时，由于正辛烷的碳链长，极性大，对药物的溶解力小，从而使各药物的Rf值降低，分离不完全，因此，应该选择短链油相－正戊烷，正己烷和正庚烷，但是正戊烷和正己烷的层析结果显示扩散和拖尾现象严重，因此，选择正庚烷为微乳液的油相。

3.1.3 SDS对展开效果的影响

微乳薄层色谱常用的表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)［1］，分别取不同量的SDS 与15.8 g 正丁醇、2.5 g 正庚烷及75.0 g重蒸馏水配成展开剂，薄层展开，各对照药材主斑点Rf值见表2。

表2 百叶各对照药材主斑点Rf值与SDS量的关系

败酱草、夏枯草和蛇床子主斑点Rf值随SDS量的增加先逐渐增大(见表2)，SDS量大于6.7 g后，变化逐渐减小。且层析结果表明SDS为6.7 g时，各斑点的分离度最好。当SDS浓度较低时，微乳液滴的增溶能力较弱，对脂溶性较大的成分增溶作用小，随着表面活性剂浓度的增加，对脂溶性成分的增溶作用增强，微乳分离能力提高，被分离成分间比移值增大。而当SDS浓度达到6.7 g，在微乳其他成分不变的情况下，对各主要组分比移值的影响并不明显。同时随着SDS浓度的增加，微乳液滴增大，展开时间延长。综合考虑选择SDS为6.7 g微乳液作为展开剂最为适宜。

3.1.4 助表面活性剂种类对分离效果的影响

微乳薄层色谱法中常加入助表面活性剂改善分离效果，本试验考察了正丁醇、异丙醇、乙醇、甲醇4种助表面活性剂对展开效果的影响，结果见表3。异丙醇不能与微乳液很好的相溶，微乳液分层，不能作为助表面活性剂。所以，助表面活性剂的种类实验最后只有正丁醇、甲醇和乙醇。

表3 助表面活性剂种类对分离效果的影响

助表面活性剂作为微乳系统中的重要组成部分，由于其分子处于胶束的表面活性剂分子之间，降低了它们的相互排斥，因此可以降低表面张力使微乳系统保持稳定。由表3可以看出，助表面活性剂的种类对分离效果的影响较大。以甲醇或乙醇代替正丁醇后，百叶各成分的Rf都明显减小，且各物质的分离度都降低，分离效果不佳。这是由于碳链较短的助表面活性剂被吸附入表面活性剂极性端的一侧，碳链较长的助表面活性剂则嵌入表面活性剂的碳链中［2］与非极性物质竞争表面活性剂分子上的非极性基团，使得表面活性剂对非极性物质的作用力减弱，非极性物质的Rf值增加。所以，选用正丁醇作为助表面活性剂最为适合。

3.2 改良剂对层析效果的影响

在保证展开剂SDS－正丁醇－正庚烷(0.27 ∶0.6 ∶0.10)+75%水组分不变的情况下，考察了多种改性剂，如甲酸，乙酸，丙酮，乙酸乙酯，氯仿，氨水等对展开效果的影响。结果表明乙酸乙酯，氯仿，丙酮加入后不能形成微乳。乙酸、氯仿的加入不能改善层析结果中的拖尾现象。甲酸的加入可明显改善斑点的拖尾现象。在此基础上考察了甲酸用量对展开效果的影响结果见图3～4。

由图3可以看出:在不含甲酸的微乳液展开剂中，有少量斑点拖尾，对分离造成不良影响，当甲酸/微乳液比例大于1/7时，败酱草、夏枯草和蛇床子的Rf值随着甲酸比例的增加而增加，并且斑点的拖尾现象逐渐改善。故甲酸加入量＞1/7即可达到效果，但从图可看出当甲酸加入量达到1/3夏枯草的Rf值略有下降，这可能是由于甲酸用量过多破坏了微乳液的稳定性的缘故。因此，选择加入1/4甲酸作为改性剂。

图3 百叶各成分的Rf值与微乳液/甲酸比例变化关系图

图4 百叶各成分的Rf值与微乳液/甲酸/丙酮比例的变化的关系图

实验中发现丙酮的加入可明显缩短展开时间且不影响展开效果，因此，选择甲酸、丙酮同时作为改性剂，以获得最佳层析效果。丙酮加入量对展开效果的影响见图4。败酱草的Rf值随着丙酮含量的增加而增大，当微乳液－甲酸－丙酮比例达到8∶2∶2后，比移值几乎没有变化;夏枯草的Rf值随着丙酮量的增加而逐渐增大，当微乳液－甲酸－丙酮比例达到8∶2∶2后，Rf值的增大幅度减少。蛇床子的Rf值也呈增大趋势，当微乳液－甲酸－丙酮比例达到8 ∶2 ∶2后，Rf值减小。并且随着丙酮的加入各主要成分的分离度逐渐增大。但丙酮量过多时可使展开时间过短，导致各成分不能得到充分的展开，分离效果不好。因此，由上图可看出微乳液－甲酸－丙酮比例为8∶2∶2时效果最佳。综上所述，在同时加入甲酸、丙酮为改性剂时可使分离效果得到显著改善。并且可以缩短层析时间。因此，选择含水量为75%微乳液－甲酸－丙酮比例为8∶2∶2的层析液为展开剂。

3.3 层析结果

含水量75%微乳液－甲酸－丙酮(4∶1 ∶1)为展开系统百叶消炎洗剂薄层色谱见图5。

图5 百叶消炎洗剂薄层色谱图

4 讨论

微乳薄层色谱的原理根据胶束色谱理论［2－3］大致相同，当以微乳为流动相时，溶质的分配可能是在固定相、微乳液的水连续相及油核和界面膜数相之间进行。由于微乳液的富集增溶，降低界面张力作用，极性大的分子分配于微乳水连续相中，极性小的分子分配于微乳油核或穿插排列于表面活性剂与助表面活性剂组成的膜栅栏中。并且由于分配、吸附、静电、疏水、立体等可能的效应，使待测药品中个组分在微乳液中展开是迁移速度不同，使其具有独特的选择性，可同时分离亲水物质和疏水物质，对带电成分和非带电成分亦有较好的分离选择，适用于分离结构和性质差别细微的复杂组分的物质，且更有利于提高色谱效率。中成药的成分复杂，有效成分的鉴定比较困难。本课题研究了微乳薄层色谱法对百叶消炎洗剂有效成分的分离鉴定。与常用展开剂相比，以微乳液作为展开剂，被测组分与其它组分的分离度显著提高，样品中检出的斑点明显增多;与对照品对应的各斑点清晰、圆而集中，即使靠近前沿，斑点也不扩散;荧光强度增强，提高了检测的灵敏度。由于一次检出组分较多，展距增加到12 cm左右，可使分离效果更加理想。本研究同时对同一药物中几种有效成分在微乳中的色谱行为进行探讨。实验表明，性质差别较大的各类组分(如夏枯草和败酱草)和性质结构差别细微的同系物可同时进行分离鉴定，为中成药有效成分的分离鉴定提供了一种高效简捷的新方法［4］。

［1］康 纯，闻璃毓，丁仲伯.微乳薄层色谱用于黄酮类药物分离鉴定的研究［J］.药物分析杂志，2000，20(2):121.

［2］张正全，陆 彬.微乳给药系统研究概况［J］.中国医药工业杂志，2001，32(3):139.

［3］戈早川，林辉概，李志良.胶束色谱与包合色谱的概况与进展［J］.分析化学，1991，19(9):1092.

［4］郭 荣，朱霞石.微乳液介质中硫氰酸铁的分光光度测定［J］.高等学校化学学报，1987，8(6):508.