非水毛细管电泳测定黄柏饮片中4种生物碱的含量

刘训红， 宋建平， 李俊松， 蔡宝昌， 韩 乐， 傅兴圣

(1.南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室，江苏南京210029;2.盐城卫生职业技术学院，江苏 盐城224006)

黄柏为传统常用中药，历版药典均有收载，《中国药典》2005年版分列为黄柏(川黄柏)、关黄柏两种，分别来源于芸香科植物黄皮树 Phellodendron chinense Schneid、黄檗 Phellodendron amurense Rupr.的干燥树皮，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮功效［1］。主要含有小檗碱、药根碱、巴马汀、木兰碱等多种生物碱成分［2］。其炮制品盐黄柏可增强滋肾阴、泻相火、退虚热等作用，临床上多用于治疗阴虚发热、骨蒸劳热，遗精、盗汗、足膝酸软等症。目前对黄柏饮片质量评价的分析方法以高效液相色谱法(HPLC)报道较多［1，3－4］，以测定其中小檗碱、药根碱、巴马汀的含量，作为药材饮片质量的控制指标。

毛细管电泳技术具有高效、高速、高灵敏度、高自动化以及样品和试剂耗用量少等一系列优点［5］。与高效液相色谱法相比，毛细管电泳清洗容易，不存在污染问题，对样品预处理要求低，进样体积小，化学试剂用量少、价廉。而且毛细管电泳方法本身需要分析带有一定电荷的物质，生物碱在结构上以含有氮原子为特点，所以毛细管电泳广泛应用于生物碱类成分的分析［6－9］。

1 仪器与试药

G1600－AX型高效毛细管电泳仪(美国Agilent公司)，配惠普化学工作站、二极管阵列检测器(DAD)、自动进样器;未涂渍标准熔融石英毛细管(64.5 cm ×75 μm，i d，有效长度56 cm，Agilent科技有限公司);Rotavapor R－3型旋转蒸发器(瑞士BUCHI公司);ShimadzuAY220电子分析天平(SPM.);pHS－25数显pH计(上海精密科学仪器有限公司);KQ－500 B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

小檗碱(berberine，批号:110713－200609)、巴马汀(palmatine，批号:110732－200506)及药根碱(jatrorrhizine，批号:733－9203)对照品购于中国药品生物制品检定所;木兰碱(magnoflorine，批号:090219)对照品购于上海融禾医药科技有限公司。硼砂、乙酸钠、氢氧化钠、乙酸铵、盐酸、甲醇、无水乙醇等化学试剂为分析纯，均购置南京药业股份有限公司;配制缓冲溶液和供试品溶液所用的水均为重蒸馏水。

不同品种、产地、批次黄柏饮片样品编号如下:S1－关黄柏(辽宁，080802，亳州中药饮片厂提供)，S2－关黄柏(吉林，亳州市药材总公司提供)，S3－关黄柏(辽宁，081001，亳州市药材总公司提供)，S4－关黄柏(东北，090326，贵州裕仁标准药材饮片开发公司提供)，S5－川黄柏(四川，081201，亳州市药材总公司提供)，S6－盐川黄柏(四川古蔺，080804浙江中医药大学中药饮片厂提供)，S7－盐川黄柏(湖南，080806，浙江中医药大学中药饮片厂提供)，S8－川黄柏(四川古蔺，080805，浙江中医药大学中药饮片厂提供)，S9－川黄柏(四川，江苏省中医院提供)，S10－川黄柏(四川，南京市传统中医门诊部提供)，S11－川黄柏(四川，南京中医药大学国医堂提供)，S12－川黄柏(四川，20081100，南京中医药大学百草堂提供)。炮制品S6、S7，由浙江中医药大学中药饮片厂按2005年版中国药典加工制得，S6相对应的生品为S8。以上样品均经品种鉴定。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液制备

分别精密称定小檗碱对照品8.20 mg、巴马汀对照品4.41 mg、药根碱对照品3.28 mg、木兰碱对照品1.30 mg，均置于同一个10 mL量瓶中，用盐酸－甲醇溶液(体积比为1∶100)溶解并定容至刻度，制成小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰碱的质量浓度分别为820、441、328、130 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备［11－12］

精密称取1 g经50℃干燥2 h后的样品粉末(过60目筛)，加入80 mL 50%(体积分数)乙醇超声提取2 h，抽滤，滤液浓缩约2 mL，转移至50 mL量瓶中，用40 mL盐酸－甲醇溶液(体积比为1∶100)超声10 min使溶解，用盐酸－甲醇溶液(体积比为1∶100)定容，用 0.45 μm滤膜过滤，滤液供NACE分析。

2.3 电泳条件

项目总预算约18.83亿元（其中中央财政约占64.9%，地方预算约占35.1%），按照3年基本建成、5年基本完善的原则安排进度。

经优化选择，确定下述电泳条件:运行缓冲液40 mmol/L乙酸钠－40 mmol/L乙酸铵－无水甲醇(pH5.8);检测波长:210 nm;分离电压:25 kV;压力进样:5 kPa×6 s;毛细管温度:20℃。毛细管使用前以0.1 mmol/L氢氧化钠溶液、重蒸馏水和运行缓冲液依次通过压力冲洗5、10、5 min，样品分析间隔用缓冲液平衡5 min。上述试剂使用前均经0.45 μm滤膜滤过，并超声脱气。

2.4 标准曲线、检测限与定量限

精密吸取混合对照品溶液0.5、1.25、2.5、5 mL，用盐酸－甲醇(1∶100)定容于10 mL量瓶中，制备对照品系列溶液，取对照品系列溶液及原母液，按上述电泳条件进样测定，以对照品的浓度(Y)对相应的峰面积(X)进行线性回归，得回归方程、相关系数及线性范围;以各化合物的信噪比等于3(S/N=3)时的相应浓度确定最低检测限(LOD);以各化合物的信噪比等于10(S/N=10)时的相应浓度确定最低定量限(LOQ)。结果见表1。

表1 标准曲线、检测限与定量限

2.5 系统适用性试验

在选定的条件下，取2.2项下的供试品溶液，按n=5.54(tR/Wh/2)2分别计算色谱柱理论板数(n);按R=2(tR2－tR1)/(W1+W2)分别计算分离度(R)。结果表明，理论板数、分离度均达到相关要求。结果见图1，表2。

图1 黄柏样品HPCE色谱图

表2 系统适用性试验

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验 取一定浓度的混合对照品溶液，重复进样5次，各对照品平均迁移时间、峰面积的相对标准偏差(RSD)见表3。

2.6.2 稳定性试验 取供试品(S2)溶液，分别在1、4、8、16、24 h 进样 5 次，4 种生物碱的平均迁移时间、峰面积的相对标准偏差(RSD)见表3。

表3 精密度、稳定性和重复性试验结果(n=5)

2.6.3 重复性试验 精密称取供试品(S2)5份，每份1 g，分别按供试品溶液制备方法制备供试液，进样测定，4种生物碱的平均迁移时间、峰面积的相对标准偏差(RSD)见表3。

2.6.4 加样回收率试验 取已知含量的样品(S3)0.5 g，5份，精密称定，分别加入一定量的小檗碱、巴马汀、药根碱及木兰碱对照品，按供试品溶液制备方法制备加样回收供试品液，并按样品测定方法进行测定，计算回收率，结果见表4。

2.7 样品测定

将供试品溶液注入高效毛细管电泳，进行测定。根据相应线性关系计算样品中小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰碱的含量。结果见表5。

3 讨论

3.1 实验对电泳条件进行了优化［10］。以电泳色谱图中小檗碱、巴马汀、药根碱及木兰碱的分离度、峰形、迁移时间等为考察指标，对缓冲液体系、缓冲液浓度、缓冲液pH、分离电压、运行温度、检测波长的优化选择，确定了上述电泳条件。

3.2 实验结果表明，不同来源、不同产地(批次)黄柏中4种生物碱的含量具有一定差异。关黄柏中小檗碱含量较低，巴马汀及木兰碱含量较高;川黄柏中小檗碱含量较高，巴马汀含量较低或未检出。关黄柏中4种生物碱的含量均以辽宁产样品为高;川黄柏以南京市传统中医门诊部提供的样品(S10)中小檗碱、药根碱及木兰碱含量为高，样品(S9)中小檗碱含量较低;关、川黄柏少数批次样品中小檗碱含量未达到2005版《中国药典》规定的HPLC法测定限量指标(≥0.6%，≥3.0%)，至于测定方法的差异尚需进一步实验比较研究。

黄柏炮制前后生物碱的含量也有一定变化，川黄柏生品(S8)与相应盐炙品(S6)比较，盐川黄柏中4种生物碱的含量均有所下降，其4种生物碱的含量变化规律仍需进一步实验探讨。

表4 加样回收率试验结果(n=5)

表5 不同产地、种属的黄柏及其炮制品中4种生物碱测定结果(mg/g，n=2)

3.3 本实验建立了非水毛细管电泳检测法同时测定黄柏饮片中小檗碱、巴马汀、药根碱及木兰碱含量的方法。该方法简单、准确，重复性好，可用于黄柏饮片内在质量的评价和控制。

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