结核性胸水中PPD特异性多功能效应型记忆T细胞表型和功能研究①

乔 丹 李 丽 李 琴 劳穗华 张贤兰 吴长有

（中山大学中山医学院免疫学教研室 中山大学“热带病防治研究”教育部重点实验室,广州 510080）

结核性胸水中PPD特异性多功能效应型记忆T细胞表型和功能研究①

乔 丹 李 丽 李 琴 劳穗华②张贤兰②吴长有

（中山大学中山医学院免疫学教研室 中山大学“热带病防治研究”教育部重点实验室,广州 510080）

目的:探讨结核性胸水中是否存在纯化蛋白衍生物（PPD）特异性T细胞,并对这群PPD特异性T细胞的表型特征和功能进行研究。方法:体外用PPD刺激结核性胸水细胞（PFCs）,结合表面分子和细胞内因子染色方法,分析结核性胸水细胞中PPD特异性的T细胞的表型特征和功能。结果:在不刺激的条件下,结核性胸水细胞几乎不产生细胞因子。PPD刺激结核性胸水细胞后,主要使CD4+T细胞产生Th1细胞因子。进一步分析Th1细胞因子产生之间相互关系,结果表明PPD特异性CD4+T细胞大多同时分泌两种细胞因子。表型分析表明,结核性胸水细胞中分泌Th1细胞因子的主要是CD45RACD62L-CD27-CCR7-CD4+T细胞,即效应型记忆CD4+T细胞。结论:结核性胸水中存在PPD特异性CD4+T细胞,这群细胞是多功能效应型记忆CD4+T细胞,而且可能对结核菌的控制和清除有重要作用。

PPD;胸水细胞;Th1细胞因子;表型;结核性胸膜炎

纯化蛋白衍生物（PPD）是由结核菌经提纯、沉 淀、脱水后的结核蛋白制成。结核菌素纯化蛋白衍生物皮肤实验,是利用受试者对进入人体的结核菌素引发的迟发性变态反应致皮肤出现硬结的机理,而用来诊断结核菌感染的一种传统方法,在结核病流行病学调查和监测、选择预防治疗对象、考核卡介苗接种质量、辅助结核病人的诊断和鉴别诊断等方面应用甚广[1-3]。

结核性胸膜炎病人约占整个结核病人群的30%,而且能够对结核分枝杆菌产生有效免疫应答,在不需要抗结核治疗的情况下能够自愈,因此成为研究结核病的很好的模型[4]。细胞免疫应答,尤其是Th1细胞介导的免疫应答,对机体抵抗结核杆菌的感染具有极其重要的意义。结核性胸水中是否存在PPD特异性T细胞,这群特异性T细胞的表型特征和功能如何,目前还不是很清楚。

本文探讨了结核性胸水中PPD特异性CD4+T细胞的表型和功能特征。结果表明,结核性胸水中存在PPD特异性T细胞,而且主要是多功能效应型记忆CD4+T细胞,可以产生两种及以上Th1细胞因子。

1 材料与方法

1.1 对象 广州市胸科医院确诊的结核性胸膜炎病人6例,其中男3例、女3例,年龄24～54岁,平均40岁。其入选标准是:（1）结合病人病史、胸膜活检、胸片X线检查、细菌学检查等确诊为结核性胸膜炎;（2）无慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌、糖尿病、高血压等合并症;（3）无遗传病家族史;（4）采集胸水之前,病人没有用激素等免疫抑制剂治疗。

1.2 材料

1.2.1 试剂 PPD由美国AerasGlobal TB Vaccine Foundation惠赠。PerCP抗人 CD4、FITC抗人 CD8、APC 抗人 IFN-γ、FITC 抗人 IFN-γ、PE 抗人 TNF-α、PE-cy7抗 人 TNF-α、APC 抗人 IL-2、FITC 抗 人CD45RA、PE 抗人 CD62L、PE 抗人 CCR7、APC抗人CD27、anti-CD28和anti-CD49d均购自美国BD公司。布雷杆氏菌素A（BFA）、皂苷（Saponin）购自Sigma公司。RPMI1640培养液、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、二巯基乙醇和Hank's液购自美国Gibco公司。葡聚糖泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。

1.2.2 仪器 流式细胞仪（BD FACSA riaⅡ,USA）,CO2培养箱（RSBiotech,USA）,酶联免疫检测仪ELx-800 Universal Microplate Reader（Bio-TEK instrument.INC）,离心机Centrifuge 5810（Eppendorf,Germany）。

1.3 方法

1.3.1 结核性胸水细胞（PFCs）的分离 利用胸腔穿刺术,抽取结核性胸膜炎病人的胸水。用Ficoll密度梯度离心法（800克,22℃,20分钟）,获得胸水单个核细胞,充分洗涤后,用RPMI1640完全培养液重悬（含100m l/L灭活胎牛血清、50 g/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素和50μmol/L二巯基乙醇）,并调整胸水细胞（PFCs）浓度为2×106细胞/m l。

1.3.2 细胞培养 用不同浓度的PPD刺激结核病人胸水细胞,放在96孔圆底板中培养,每孔200μl,3个复孔。37℃、5%CO2培养箱孵育3天后,收集细胞培养上清,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IFN-γ的产生。

1.3.3 ELISA ①用鼠抗人IFN-γ单克隆抗体包被ELISA板,4℃放置过夜,用含0.05%Tween-20的PBS溶液洗涤后,加入含10%FCS的PBS溶液,室温封闭1小时;②按照说明书配制标准品并稀释样品,加入ELISA板中,室温孵育2小时;③洗板后,加入生物素标记的鼠抗人IFN-γ单克隆抗体及亲合素标记的辣根过氧化物酶,室温孵育1小时;④洗板后,加TMB显色剂,室温避光放置30分钟左右,加10%硫酸终止反应;⑤用酶标仪读板。IFN-γ ELISA试剂盒检测灵敏度为4.7 pg/ml。

1.3.4 细胞表面和细胞内因子的染色及分析 用PPD刺激胸水细胞,37℃、5%CO2培养箱孵育,在培养过程中加入BFA。收集培养后的PFCs,用PBS洗涤2次。去上清后重悬,分别加入不同荧光素标记的抗人CD4、CD8、CD45RA 、CD62L 、CCR7、CD27mAb,4℃避光反应25分钟。孵育结束后,加PBS洗一次,每管加40克/L多聚甲醛2ml,室温固定8分钟。加PBS洗两次。去上清,加入含有皂苷的破膜缓冲液过夜。分别加入不同荧光素标记的抗人IFN-γ、抗人TNF-α或抗人IL-2,4℃避光反应30分钟。孵育结束后,加PBS洗一遍后重悬。应用流式细胞检测仪（BD FACSAriaⅡ）检测细胞,并用Flow Jo软件分析流式检测结果。在进行流式分析时,首先设门于淋巴细胞,然后设门于CD4+和CD8+T细胞;观察这些细胞亚群中细胞因子的表达及其表型特征。

2 结果

2.1 PPD以剂量依赖方式诱导PFCs产生IFN-γ为了确定PPD的最适刺激浓度,我们加入不同浓度的PPD,在anti-CD28和anti-CD49d存在条件下,刺激结核性PFCs,用ELISA的方法检测培养上清液中产生的IFN-γ。结果表明（图 1）,不刺激条件下,结核性PFCs几乎不产生IFN-γ。与不刺激条件相比,PPD刺激可以显著增加PFCs产生IFN-γ,差别具有统计学意义（P＜0.01）。并且随着PPD刺激浓度的增加,IFN-γ产生量也逐渐增加。

2.2 PPD刺激PFCs中CD4+T细胞产生IFN-γ和TNF-α 为了确定结核性胸水中PPD特异性细胞因子的来源,我们检测了PFCs中CD4+和CD8+T细胞产生的IFN-γ和TNF-α。如图所示,在不刺激的条件下,无论是CD4+还是CD8+T细胞都几乎不产生细胞因子（图2A）。而PPD刺激主要诱导CD4+T细胞产生IFN-γ和TNF-α（图2B）。统计分析表明,PPD主要诱导CD4+T细胞产生Th1细胞因子,与CD8+T细胞相比,差别具有统计学意义,P＜0.01（图2C）。

图1 PPD以剂量依赖方式诱导PFCs产生IFN-γ（n=3）Fig.1 A dose-dependent production of IFN-γby PFCs induced by PPD（n=3）

图2 PPD主要刺激 PFCs中 CD4+T细胞产生IFN-γ和TNF-αFig.2 Production of IFN-γand TNF-αby CD4+T cells in PFCs induced by PPD

2.3 PPD诱导CD4+T细胞产生Th1细胞因子之间的关系 PPD可诱导PFCs中CD4+T细胞产生IFN-γ、IL-2和TNF-α（图 3A）。进一步研究三种细胞因子产生之间的关系,由图3B可以看出,对于任意两种细胞因子的表达,都存在两个单阳性和一个双阳性共三个细胞亚群,但三个亚群的比例有差异。对于IFN-γ和IL-2来说,IFN-γ+细胞占4.16%,IFN-γ+IL-2+细胞占4.2%,IL-2+细胞占1.02%。对于IFN-γ和TNF-α来说,IFN-γ+细胞占0.5%,IFN-γ+TNF-α+细胞占7.86%,TNF-α+细胞占3.48%。对于IL-2和TNF-α来说,IL-2+细胞占 0.29%,IL-2+TNF-α+细胞占5.32%,TNF-α+细胞占6.02%。统计分析表明,对于 IFN-γ和 IL-2,以 IFN-γ+或 IFN-γ+IL-2+细胞为主,分别占整个阳性细胞的44%和45%;对于IFN-γ和TNF-α,以 IFN-γ+TNF-α+为主,占整个阳性细胞的63%;对于IL-2和 TNF-α,则以 TNF-α+或 IL-2+TNF-α+为主,分别占整个阳性细胞的 53%和43%（图 3C）。

图3 PPD诱导CD4+T细胞产生Th1细胞因子之间的关系Fig.3 Correlation of Th1 cytokinesproduced by CD4+T cells induced by PPD

图4 PPD特异性Th1细胞的表型特征Fig.4 Phenotypic characterization of PPD specific Th1 cells

2.4 结核性胸水中PPD特异性Th1细胞的表型特征

为了进一步了解PPD特异性的Th1细胞的表型特征,我们同时检测了PPD特异性Th1细胞的表面分子和细胞内因子。结果表明,产生IFN-γ、IL-2或TNF-α的细胞主要是效应型记忆CD4+T细胞,这群细胞的表型特征为CD45RA-CD62L-CD27-CCR7-细胞。统计分析表明,PPD特异性产生IFN-γ、IL-2或TNF-α的Th1细胞亚群分布相似。PPD特异性IFN-γ+CD4+T细胞中,CD45RA-CD62L-细胞亚群占97.6%,CD45RA-CCR7-细胞亚群占82.95%,CD45RA-CD27-细胞亚群占83.8%（图4A）。PPD特异性IL-2+CD4+T细胞中,CD45RA-CD62L-细胞亚群占93.85%,CD45RA-CCR7-细胞亚群占72.1%,CD45RA-CD27-细胞亚群占 85.7%（图4B）。PPD特异性TNF-α+CD4+T细胞中,CD45RACD62L-细胞亚群占96.2%,CD45RA-CCR7-细胞亚群占76.15%,CD45RA-CD27-细胞亚群占84.25%（图4C）。

3 讨论

在结核性PFCs中,T淋巴细胞是由多种表型和功能不同的细胞亚群组成。根据功能和MHC分子的限制性不同,T细胞可分为CD4+和CD8+T细胞;根据CD45RA的表达与否,将T细胞分为初始T细胞（CD45RA+）和记忆T细胞（CD45RA-）两大亚群;初始T细胞高表达CD27和CD62L,而记忆T细胞低表达或不表达CD62L。此外,根据CCR7表达与否,又可将记忆T细胞分为效应型（TEM）和中央型（TCM）两大亚群[5-7]。CD45RA、CD27和CD62L表达与否是鉴别初始和记忆T细胞最常使用的表面标志。当首先分析CD45RA的表达,然后分析CD27和CD62L表达时,三者在初始CD4+和CD8+T细胞的符合率分别为98.8%和95.2%[8]。

本文利用多色流式细胞检测技术,以及目前国内外常用鉴别初始和记忆T细胞表面标志的抗体,在单个细胞水平上对结核性PFCs中PPD特异性T细胞亚群进行了分析。同时还分析了PPD特异性Th1细胞产生细胞因子之间的关系及其表型特征。

在抵抗结核菌感染的过程中,细胞免疫应答发挥着重要作用。CD4+和CD8+T细胞是细胞免疫应答的重要组成部分,IFN-γ是对结核菌产生有效细胞免疫应答的关键细胞因子。IFN-γ主要由激活的CD4+和CD8+T细胞以及NK细胞产生,是单核巨噬细胞的强激活剂,能够激活巨噬细胞,增强其有效清除结核菌的能力[9-11]。TNF-α协同IFN-γ激活被结核菌感染的巨噬细胞,募集巨噬细胞和淋巴细胞迁移至感染部位,封闭感染的病灶并形成肉芽肿,限制结核菌的进一步播散,从而产生抗结核的免疫保护作用[12,13]。IL-2的功能主要是促进T细胞增殖,是T细胞的生长因子,还可使CD8+T细胞活化为CTL,并且可诱导IFN-γ等多种细胞因子的分泌,从而产生杀灭结核的作用[14]。

本研究表明,结核性PFCs在不刺激条件下,几乎不产生任何细胞因子;PPD刺激可以显著增加Th1细胞因子的产生。PPD主要刺激PFCs中CD4+T细胞产生IFN-γ和TNF-α。结核性PFCs中,PPD特异性的细胞主要是效应型记忆CD4+T细胞,表型特征为CD45RA-CD62L-CD27-CCR7-T细胞。利用表面分子和趋化因子受体将这些Th1细胞因子阳性细胞分群,发现分泌这三种Th1细胞因子的细胞亚群表型相似,都是以CD45RA-CD62L-,CD45RACD27-,CD45RA-CCR7-为主,尤其是 IL-2和TNF-α的亚群分布基本一致,这可能是由于产生IL-2的细胞几乎同时都产生TNF-α。

目前用于确诊结核的金标准仍是细菌学检查,但是胸水培养的阳性率很低,不利于结核的早期诊断,也很难区分结核性胸水和其它原因引起的胸腔积液;PPD主要集中在皮试方面的应用[15]。本研究通过分析PPD刺激后,结核性PFCs产生Th1细胞因子的类型及表型特征,使我们对PPD在结核中的作用有了更进一步的了解,也为PPD更广泛应用于临床诊断提供了依据。

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14 Sallusto F,Lenig D,Forster Retal.Two subsetsofmemory T lymphocyteswith distinct hom ing potentials and effector functions[J].Nat Immunol,1999;14:659-660.

15 Cosmi L,Maggi L,Santarlasci Vetal.Detection by flow cytometry of ESAT-6-and PPD-specific circulating CD4+T lymphocytes as a diagnostic tool for tuberculosis[J].Int ArchAllergy Immunol,2007;143（1）:1-9.

[收稿2010-05-10 修回2010-06-02]

（编辑 张晓舟）

A study on the phenotypic characterization and function of PPD specificmuli-functional effector memory T cells in pleural fluids

QIAODan,LILi,LIQin,LAOSui-Hua,ZHANGXian-Lan,WUChang-You.DepartmentofImmunology,Zhongshan SchoolofMedicine,KeyLaboratoryofTropicalDiseaseControl（SunYat-SenUniversity）,MinistryofEducation,Guangzhou510080,China

Objective:To explorewhether PPD specific T cells exist in pleural fluids from patientswith tuberculosis pleurisy and analyze the phenotypic characterization and function of these cells.Methods:Pleural fluid cellswere incubated with PPD in vitro.Cell surface staining and intracellular stainingwere used to analyze the production of cytokines by PPD specific T cells and the phenotypic characterization.Results:Pleural fluid cells didn't p roduce any cytokine inmedium alone.Following the stimulation with PPD in vitro,CD4+T cells in pleural fluidswere themain source of PPD specific Th1 cytokines.Further we investigated the correlations among the Th1 cytokine production,and found that these PPD specific CD4+T cellsmainly coexpressed two Th1 cytokines（IFN-γ,IL-2 or TNF-α）.Phenotypic analysis indicated that these cytokine-producing pleural fluid cellweremainly polyfunctionaleffectormemory CD4+T cellswith the phenotypeof CD45RA-CD62LCD27-CCR7-.Conclusion:Our data indicats that PPD specific CD4+T cells exist in pleural fluids from patientswith tuberculosis pleurisy.These cells are polyfunctional effectormemory CD4+T cells,which could produce two ormore Th1 cytokines.Theymay play an important role in the control ofmycobacterium tuberculosis infections.

PPD;PFCs;Th1 cytokines;Phenotype;Tuberculosis,pleurisy

R392

A

1000-484X（2010）12-1114-05

①本文为十一五基金（2008ZX10003011）和国家自然科学基金资助项目（30872300）

②广州市胸科医院,广州510095

乔 丹（1984年-）,女,在读博士,主要从事免疫记忆方面的研究,E-mail:qiaodan840924@163.com;

及指导教师:吴长有（1955年-）,男,教授,博士生导师,主要从事疫苗和免疫记忆方面的研究,E-mail:Changyou-wu@yahoo.com。

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.013