面神经损伤后MnTBAP对面神经元的保护作用

于洋，黄绍辉，刘敏达，王绪凯

（中国医科大学 附属口腔医院口腔颌面外科教研室，口腔颌面头颈外科，沈阳 110002）

面神经损伤后MnTBAP对面神经元的保护作用

于洋，黄绍辉，刘敏达，王绪凯

（中国医科大学 附属口腔医院口腔颌面外科教研室，口腔颌面头颈外科，沈阳 110002）

目的 观察锰苯甲酸卟啉（MnTBAP）对大鼠面神经挤压伤后神经元的保护作用及对caspase-3表达的影响。方法 制作大鼠双侧面神经总干挤压伤模型，左侧损伤局部给予MnTBAP，右侧给予生理盐水作为对照。于伤后1，3，7，14，28，42d时，观察大鼠面瘫恢复情况；HE染色观测术后面神经元的形态学变化；免疫组化检测caspase-3表达的变化。结果 MnTBAP对总干挤压伤后的面神经有明显的功能恢复作用；伤后第3日开始，MnTBAP侧和对照侧面神经元存活率逐渐下降，第7日开始，MnTBAP侧面神经元存活率明显高于对照侧（P<0.05）；伤后第3日，caspase-3表达增加，第14日时达高峰，各时间点表达水平MnTBAP侧低于对照侧（P<0.05）。结论 MnTBAP有助于挤压伤后面神经功能恢复，降低caspase-3的表达、抑制细胞凋亡可能是MnTBAP治疗创伤性面瘫的重要机制之一。

面神经元；锰苯甲酸卟啉；凋亡

外伤性面神经损伤是面瘫发病的重要原因［1］，占面瘫发病率的17%［2］。目前，临床常采用的显微外科技术虽可较好的恢复神经的连续性，但神经功能的恢复仍不令人满意。锰苯甲酸卟啉［Mn（Ⅲ）tetrakis（4-benzoic acid）porphyrin chloride，MnTBAP］分子式为C48H28ClMnN4O8，是含有金属锰的卟啉药物，是超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）类似物和广谱的游离基清除剂，它本身同时具有SOD和过氧化氢酶（catalase，CAT）的特性，且具有无毒、稳定、细胞膜通透性佳的特性［3］。目前MnTBAP主要应用于脑和脊髓神经系统损伤的治疗，而将其用于面神经损伤治疗的研究尚未见报道。本研究旨在观察大鼠面神经损伤后对其神经元的存活和caspase-3蛋白表达的影响，探讨MnTBAP对创伤性面瘫的神经保护作用及可能机制，以期为外周神经损伤提供新的药物治疗方法。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠40只（中国医科大学动物实验中心提供），体质量250～300g，雌雄不限，随机分为术后饲养 1、3、7、14、28和 42d 6个组，每组各 5只动物，每只动物为自身对照。另外10只大鼠作为假手术组。原位末端标记（TUNEL）凋亡检测试剂盒、caspase-3一抗（多克隆抗体）、即用型SABC试剂盒（包括正常封闭血清、生物素化二抗、SABC、抗原修复液）及DAB染色液均由武汉博士德生物工程有限公司生产。MnTBAP由美国Calbiochem公司生产。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备：水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射麻醉动物。解剖分离两侧的面神经总干，在双侧茎乳孔用特定蚊式钳三扣结钳夹面神经总干（长约2mm）同一部位2次，每次30s，间隔15s。MnTBAP治疗组：在左侧神经近心端断端处置浸满MnTBAP（4mg/kg），约3mm×3mm×3mm 大小的医用胶原蛋白海绵块；在右侧面神经近心端断端处置同样大小浸满生理盐水的胶原蛋白海绵块做为对照组。假手术组：仅暴露双侧面神经总干而不损伤神经，缝合皮肤。各组大鼠标记后分笼饲养。自手术后开始至灌注前，每日观察动物触须节律性拂动及眨眼反射的恢复情况。

1.2.2 取材和切片：实验动物在预定时间行大体观察后，再次用水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射麻醉，采用经左心室插管，升主动脉快速灌注生理盐水150～200ml，用4℃、4%多聚甲醛350ml灌注固定，开颅取脑干，以小脑桥延沟为中心，左右水平切取约2mm厚的脑组织块，放置于4%的多聚甲醛中进行后固定。常规石蜡包埋，依据大鼠脑立体定位图谱［4］定位面神经核横断面，5μm连续切片，每间隔5张取1张切片，共收集4套切片，每套均为3张切片，分别用于HE染色、caspase-3免疫组化及TUNEL凋亡检测。

1.2.3 面神经元的记数方法：面神经元胞体直径约20～25μm，尼氏体染色均匀者，或胞核、核仁明显位于胞体中央者均在记数范围内。面神经核团内神经元（facial motoneurons，FMNs）计数在 Olympus显微镜下（×200）进行。每只动物随机取4张切片计算左右两侧面神经核团中运动神经元的数目，分别得出左右两侧运动神经元数目与假手术组运动神经元数目之比，为该侧运动神经元存活百分率。

1.2.4 TUNEL凋亡检测：采用原位末端标记法，按照试剂盒说明书操作，阳性结果以细胞核被染成棕黄色为准。每只动物随机取4张切片，每张切片面神经核计数5个高倍镜视野（×200），取平均值，为该切片凋亡细胞数。

1.2.5 caspase-3免疫组化检测：每只动物随机取4张切片，按SABC法进行免疫组化染色，滴加一抗（1∶100比例稀释），DAB染色，按照说明书步骤操作。阳性结果以胞质或胞核内出现棕黄色染色为准。显微镜下观察，每张切片观察计数5个视野（×200），取平均值，为该片的阳性细胞数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大体观察

正常情况下，大鼠触须向前竖起并有节律性地拂动，能完全闭眼。面神经损伤后所有动物进食、活动正常。伤后1d双侧触须集中伸直并向后伸展呈倒伏状，完全不能拂动，无闭眼动作，呈现完全性面瘫。伤后7d MnTBAP治疗组触须仍倒伏，轻微拂动，有上睑轻微闭眼动作；伤后14d，触须向前恢复竖起，有节律性地拂动，动度和速度接近正常，能完全闭眼，面瘫症状基本恢复。伤后14d对照组触须仍倒伏，轻微拂动，无闭眼动作；伤后28d触须回到正常位置，拂动基本与对侧一致，能完全闭眼，面瘫症状基本完全恢复。

2.2 光镜观察

正常面神经核团中神经元透亮、光滑、无皱缩。胞体直径约20～25μm，胞核居中，HE染色后呈深紫色，核仁淡紫色，位于胞体中央，胞质中尼氏小体染色均匀为淡紫色，轴突明显。伤后第1日时，可见MnTBAP治疗组大鼠面神经元大部分细胞仍保持正常形态，对照组神经元在光镜下胞体缩小变圆，不规则，胞质浓缩，染色加深，胞核皱缩变小，轴突不明显但胞膜完整，偶见胞体肿胀变圆。从伤后第3日开始MnTBAP治疗组和对照组面神经元存活率逐渐下降，伤后第28日存活率达到最低，伤后第42日与28日比较差异无统计学意义（P>0.05）。各时间点MnTBAP治疗组和对照组面神经元存活率变化一致，但从第7日开始MnTBAP治疗组面神经元存活率明显高于对照组（P<0.05）（表1）。

2.3 TUNEL染色检测

TUNEL阳性细胞核被染成棕黄色，假手术组、对照组和MnTBAP治疗组损伤后第1、3日均未见阳性表达，第7日开始MnTBAP治疗组和对照组可见TUNEL阳性表达，于第14日达到高峰，阳性细胞最多，随后阳性细胞数量减少，伤后28d、42d时可见少量阳性细胞表达。MnTBAP治疗组和对照组比较，TUNEL阳性表达时间变化一致，但各时间点表达水平 MnTBAP治疗组较对照组低（P<0.05）（图 1，2）。

表1面神经损伤后不同时间点面运动神经元的存活率（±s，%）Ta b.1Su r v i v a l r a t e o f f a c i a l n e u r o n s a t d i f f e r e n t p o i n t s a f t e r f a c i a l n e r v e i n j u r y（±s，%）Time after facial nerve injury Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 Day 28 Day 42MnTBAP-treated 84.49±1.01 83.33±1.75 68.71±1.021） 62.28±2.321） 56.43±0.511） 65.79±2.321）Sham-operated 84.79±1.37 81.58±2.32 62.86±1.83 53.80±1.34 42.69±1.01 52.92±1.34Group 1）P<0.05vs sham-operated group.

2.4 caspase-3免疫组化检测

结果如表2及图3所示：（1）假手术组面神经核未见 caspase-3阳性表达；（2）伤后第 3日时，caspase-3表达水平开始升高，于第14日时达到高峰，第28日表达水平下降，伤后第42日时仅可见少量阳性表达。MnTBAP治疗组和对照组caspase-3阳性表达时间变化一致，但各时间点表达水平MnTBAP组较对照组低（P<0.05）。

表2Mn TBAP对损伤后面神经元内c a s p a s e-3的影响（±s）Ta b.2Ef f e c t o f Mn TBAPo n c a s p a s e-3e x p r e s s i o n i n f a c i a l n e u r o n s a f t e r f a c i a l n e r v e i n j u r y（±s）Time after facial nerve injury Day 3 Day 7 Day 14 Day 28 Day 42MnTBAP-treated 4.25±1.501） 49.25±4.921） 79.75±3.771） 28.25±2.751） 21.50±2.521）Sham-operated 10.50±3.87 67.00±5.48 93.50±3.87 36.25±3.86 27.25±3.10Group 1）P<0.05vs sham-operated group.

3 讨论

3.1 面神经损伤后神经元的改变

面神经损伤后，其胞体从靶器官获取的神经营养因子减少，出现形态改变，并不可避免地引起一定数量的神经元死亡［5，6］。有证据表明［7，8］，大鼠面神经挤压伤后50%的神经元发生死亡，损伤后神经元死亡是一个复杂的过程，死亡形式包括坏死和凋亡两种方式。其中凋亡作为一个可调控的细胞死亡过程，是周围神经损伤后中枢神经元死亡的主要原因［9］。本研究结果显示，面神经损伤后，其神经元胞体缩小、胞质浓缩，轴突不明显，但胞膜完整，其形态学改变符合凋亡细胞的表现，且神经元数目明显少于假手术组（P<0.05），同时神经元存活率随时间延长逐渐降低，伤后第28日面神经元存活率达到最低，提示面神经损伤后可发生面神经元凋亡，这与以往学者的研究结果一致。

3.2 MnTBAP对面神经损伤后神经元的保护作用

神经元凋亡是神经损伤最主要的表现之一，长久以来对其研究的重点都集中在给与神经营养因子，抗凋亡以及减少自由基产生等治疗策略，这些策略的共同点都是直接围绕着如何抑制神经元细胞凋亡而设计的。凋亡的发生是一个复杂的、由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。caspase-3在蛋白酶级联切割过程中处于核心位置，不同的蛋白酶分别切割caspase-3酶原，从而激活caspase-3，活化的caspase-3又进一步分割不同的底物，导致蛋白酶级联切割效应放大，最终使细胞走向死亡［10～12］。我们的结果显示，面神经挤压伤后3d时，面神经元中caspase-3蛋白表达增强，并于术后14d达到高峰。表明caspase-3作为caspase系统的最终效应酶而参与凋亡。

本研究采用MnTBAP作用于损伤后的大鼠面神经，以探讨其对创伤性面瘫的神经保护作用及可能机制。有文献报道，MnTBAP药物本身具有广谱游离基清除作用外，在减少细胞凋亡方面也具有重要作用。Lee等［13］发现小鼠局灶性脑缺血损伤后，MnTBAP对超氧游离基具有明显的清除作用，且能够明显减少神经细胞凋亡和DNA损伤；Aladag［14］发现MnTBAP能减少脑血管痉挛后超氧游离基的产生和细胞凋亡。Day等［15］发现MnTBAP具有明显减少脊髓损伤后产生的羟基游离基（-OH）的氧化损伤和细胞凋亡作用。

本研究结果表明，局部应用MnTBAP后，伤后第7日开始，MnTBAP治疗组大鼠面神经元存活率明显高于对照组（P<0.05），说明MnTBAP能够减少面神经损伤后神经元的死亡数量，并对面神经元凋亡有明显抑制作用。同时免疫组织化学结果证明，面神经损伤后，尽管MnTBAP治疗组与对照组caspase-3蛋白表达水平均出现先升高再下降，但其表达水平较对照组显著降低（P<0.05），进一步说明MnTBAP可能通过抑制caspase-3的表达，抑制面神经元的凋亡。

综上所述，我们初步证实了外源性的MnTBAP是一种有效的神经保护剂，损伤后早期给药将有助于抑制面神经元的凋亡。但MnTBAP在外周神经损伤中的保护和促进神经再生的具体作用机制还有待进一步的研究。

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（编辑 王又冬，英文编辑 陈 姜）

Neuroprotective Effect of MnTBAPon Facial Neurons after Facial Nerve Injury in Rats

YUYang，HUANGShao-hui，LIUMin-da，WANGXu-kai
（Division of Oral and Maxillofacial-Head and Neck Surgery，Department of Oral and Maxillofacial Surgery，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo observe the neuroprotective effect of MnTBAPafter facial nerve crush and the effect of MnTBAPon the expression of caspase-3in rats.MethodsFacial nerve injury model was established by crushing bilateral facial nerves of 40SDrats，and then the left and right facial nerves were treated with MnTBAP（MnTBAP-treated group）and normal saline（sham-operated group），respectively.On days 1，3，7，14，28，and 42after the facial nerve injury，the recovery of facial paralysis was observed；the morphology of facial neurons was observed under light microscope；and the expression of caspase-3was detected by immunohistochemistry.ResultsThe faical nerve in MnTBAP-treated group showed obvious recovery of function after facial nerve crush.The survival rates of facial neurons in both groups decreased gradually since day 3，and the survival rate of facial neurons in MnTBAP-treated group was significantly higher than that in shamoperated group since day 7.The expression of caspase-3increased since day 3and reached the peak on day 14.The expression level of caspase-3in MnTBAP-treated group was significantly lower than that in sham-operated group at each time point.ConclusionMnTBAPcould promote the recovery of function after facial nerve crush.Inhibiting the apoptosis and decreasing the expression of caspase-3may be involved in the mechanism of the treatment of traumatic facial paralysis by MnTBAP.

facial neuron；MnTBAP；apoptosis

R782.4

A

0258-4646（2010）11-0915-04

沈阳市科学技术计划项目（200340）

于洋（1983-），女，硕士研究生.

黄绍辉，E-mail：huangshaohui@hotmail.com

2010-06-24