锌对前列腺癌22RV1细胞的增殖及ZIP4mRNA表达的影响

2010-02-03 07:40陈启光马东蔚张哲单广夷孔垂泽
中国医科大学学报 2010年11期
关键词:前列腺癌离子活性

陈启光,马东蔚,张哲,单广夷,孔垂泽

(中国医科大学 附属第一医院1.泌尿外科;2.内分泌科,沈阳 110001)

锌对前列腺癌22RV1细胞的增殖及ZIP4mRNA表达的影响

陈启光1,马东蔚2,张哲1,单广夷1,孔垂泽1

(中国医科大学 附属第一医院1.泌尿外科;2.内分泌科,沈阳 110001)

目的 探讨锌对前列腺癌22RV1细胞的增殖及对ZIP4mRNA表达的影响。方法 采用倒置相差显微镜观察并采用MTT法检测不同浓度锌(0.5、5、50、100μmol/L)对前列腺癌22RV1细胞的形态及增殖活性的影响,实时定量RT-PCR法检测不同浓度锌在不同时间点对ZIP4mRNA表达的影响。结果 在锌浓度为0.5μmol/L时,细胞皱缩,形态发生明显变化,增殖活性下降,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01),其余3组未见明显变化(P>0.05)。随着锌作用时间的延长,ZIP4mRNA表达量下降,36h达最低值之后保持恒定;当锌浓度为0.5μmol/L时,ZIP4mRNA的表达量变化与对照组相比无统计学差异(P>0.05),其余各浓度组变化均有统计学差异(P<0.01)。结论 锌在一定浓度水平上可以抑制前列腺癌22RV1细胞的增殖活性,且对ZIP4mRNA的表达具有时间和剂量依赖性。

锌;前列腺癌;22RV1;增殖;ZIP4

锌是人体必须的微量营养元素之一,是体内200多种含有锌指结构的酶和转录因子保持活性并参与细胞结构组成和催化活性的必要组成部分[1,2]。与锌相关的某些酶在缺氧、血管生成、细胞增殖和肿瘤转移中扮有重要角色。研究表明,与正常前列腺组织相比,前列腺癌组织中锌浓度下降达62%~75%[3,4],前列腺的外周带具有高度特异性的腺分泌上皮细胞能聚集高浓度的锌离子,是前列腺癌的好发部位,因而推测锌在前列腺癌的发生发展中可能起重要作用。锌铁调控蛋白(ZRT,IRT-like protein,ZIP)家族是新近发现的一类金属离子转运体,其主要功能是将锌离子转入细胞内,与锌转运体(zinc transporter,ZnT)家族共同作用维持细胞内锌离子的稳定,ZIP4是ZIP家族的一员,在锌离子的吸收转运中起重要作用[5]。本研究以不同浓度的锌离子作用于前列腺癌22RV1细胞,观察其对细胞增殖活性及对细胞内ZIP4mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

RPMI1640培养基、0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone公司),胎牛血清(TBD公司),TRIZOL(Invitrogen公司),SYBR誖PrimeScriptTMRT-PCRKit II(Perfect Real Time)(Takara公司),引物由大连宝生物工程有限公司设计合成,ZnCl2购自国药集团(分析纯试剂)。紫外分光光度计(美国Thermo公司),ROTOR-GENE6000离心式荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett公司)。

1.2 细胞培养

用含15%胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养前列腺癌22RV1细胞,置于37℃、饱和湿度、5%CO2的孵箱内,隔日换液,用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液隔日消化、传代。

1.3 MTT法检测细胞增殖能力

取对数生长期细胞,以每孔3×103个细胞接种于96孔板内,待细胞完全贴壁后,分别加入终浓度为 0.5μmol/L、5μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的ZnCl2,每孔终体积为 200μl,每个浓度设 5个平行孔,同时设调零孔和对照孔,周边孔用PBS填充,置37℃、5%CO2孵箱中,分别于 12h,24h,36h,48h,60h终止培养,每孔加入新鲜配制的MTT溶液(5mg/ml),于37℃继续孵育4h后弃孔中培养液,加入150μl DMSO(二甲基亚砜),避光低速振荡10min,于酶标仪上波长490nm处测定各孔吸光度值(A值)。

1.4 总RNA提取及cDNA的合成

不同浓度 ZnCl2作用 12h,24h,36h及 48h后,按5×106~1×107个细胞加1ml TRIZOL低温吹打;按说明书提取总RNA。用DEPC处理的超纯水溶解RNA,60℃孵育5min,1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,分光光度计测定其260nm吸光度和浓度。cDNA合成的反应体系:(1)5×PrimeScriptTMbuffer(for Real Time)4μl;(2)PrimeScriptTMRTenzyme mix I1μl;(3)Oligo dTprimer(50μmol/L)1μl;(4)Random 6mers(100μmol/L)1μl;(5)total RNA1μg;(6)加 RNase free dH2O至 20μl反应体系。反转录反应条件:37℃,15min;85℃,15s反转录成cDNA,-20℃保存备用。

1.5 实时定量PCR

采用SYBRGreen嵌合荧光进行反应,按说明书配制 12.5μl的反应体系:(1)SYBR誖Premix Ex TaqTMII(2×)6.25μl;(2)PCRforward primer(10μmol/L)0.5μl;(3)PCRreverse primer(10μmol/L)0.5μl;(4)模板(cDNA溶液)1μl;(5)dH2O4.25μl。阴性对照组加入未反转录的RNA作为模板。引物序列:ZIP4上游:5′ATGTCAGGAGCGGGTCTTGC3′;下游:5′GCTGCTGTGCTGCTGGAAC3′。β-actin上游:5′TGGCACCCAGCACAATGAA3′;下游:5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA3′。反应条件如下:95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火 20s,72℃延伸30s同时获取荧光,共40个循环,行产物的溶解曲线分析。

1.6 Comparative Delta-delta Ct法行相对定量分析

首先选前列腺癌细胞株22RV1标本作为校正组,然后对样品中的目的基因DD3与管家基因βactin分别连续10倍稀释后做标准曲线,通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近;将扩增效率优化为一致,然后对目的基因和内参分别进行扩增。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度Zn2+对22RV1细胞形态的影响

分别于不同的时间点在倒置相差显微镜下观察不同浓度Zn2+对前列腺癌22RV1细胞形态的影响,在锌离子浓度为0.5μmol/L时可明显观察到22RV1细胞突起消失,细胞皱缩变圆,部分细胞悬浮,而在其余 3个浓度(5μmol/L、50μmol/L和 100μmol/L)时细胞形态未见明显变化。见图1。

2.2 不同浓度锌对22RV1增殖活性的影响

分别于不同的时间点采用MTT法检测不同浓度锌离子对细胞增殖活性的影响,结果显示,在锌离子浓度为0.5μmol/L时,细胞的增殖活性明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01),其余3组与对照组相比,Zn2+对细胞增殖活性的影响无统计学差异(P>0.05)。见图2。

2.3 锌对22RV1细胞ZIP4mRNA表达的时间效应

实时定量RT-PCR法分别检测不同浓度锌离子在各个时间点对22RV1细胞ZIP4mRNA表达的影响。结果显示,随着锌作用时间的延长,ZIP4表达量呈下降趋势。在锌浓度为50μmol/L时,相对于对照组在 12h,24h,36h,48h,72h 时ZIP4mRNA表达量变化分别为 0.98±0.05,0.66±0.04,0.46±0.02,0.44±0.02,0.45±0.02。在 12h 时ZIP4mRNA表达量未见明显变化(P>0.05),36h时ZIP4mRNA下降达到最低值,之后恒定保持在较低水平,与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)。见图3。

2.4 锌对22RV1细胞ZIP4mRNA表达的剂量效应

实时定量RT-PCR法检测了不同浓度锌离子对22RV1细胞作用36h后ZIP4mRNA表达量的变化。结果显示,ZIP4mRNA的表达水平随锌离子浓度的上升而下降,与对照组相比,在锌离子浓度为0.5μmol/L,5μmol/L,50μmol/L和 100μmol/L时ZIP4mRNA的表达量分别为 0.95±0.03,0.74±0.03,0.46±0.02,0.29±0.07。与对照组相比,锌浓度为 0.5μmol/L时,ZIP4mRNA的表达量变化无统计学意义(P>0.05),其余各组变化均有统计学意义(P<0.01)。见图 4。

3 讨论

锌是很多细胞和组织必须的微量元素,正常前列腺组织中的锌含量是其他组织的3~10倍[6],其聚锌能力主要由前列腺外周带高度特异性的腺分泌上皮细胞完成,Franklin等[7]将这些细胞称为“聚锌细胞”。Habib等[8]的研究表明,在前列腺癌发生的早期阶段,腺体中的锌浓度便开始下降,“聚锌细胞”的聚锌能力开始丧失,提示锌在前列腺癌的形成阶段即开始起作用。锌铁调控蛋白ZIP与许多恶性肿瘤的进展有关,它在乳腺癌和胰腺癌进展中的作用已经得到部分证实[9,10]。Desouki等[11]认为,在前列腺癌中ZIP1、ZIP2和ZIP3均表达下调的同时伴锌水平下降,表明ZIP1、ZIP2和ZIP3可能是一组抑癌基因。ZIP4是由SLC39A4基因所编码的一种锌铁调控蛋白,在胃肠道上皮中呈高表达,可通过促进食物中的锌进入肠道上皮细胞和囊泡中锌的释放而维持细胞内锌的水平[1,12]。研究显示,ZIP4的表达缺失与肌皮炎相关,其过表达与胰腺癌的发生发展有着密切关系[2,10,13]。但到目前为止,ZIP4在前列腺癌中的表达及其生物学机制还不是很清楚。

本研究首次在细胞水平探讨了锌对前列腺癌22RV1细胞形态及细胞内ZIP4mRNA表达的影响。结果表明,在锌离子浓度为0.5μmol/L时,细胞形态发生明显改变,细胞增殖活性明显下降,而其他相对较高锌浓度时却未观察到此现象。因而我们推测其可能机制是:(1)锌离子在一定浓度范围内变化时,细胞对自身锌离子稳态监测未启动,导致细胞内锌离子浓度不断增加,产生细胞毒性抑制细胞增殖或直接导致细胞死亡;(2)通过抑制细胞周期的某一阶段或通过某种机制启动凋亡信号通路而使细胞增殖活性下降凋亡增加,对此作用机制的推测我们会通过后续研究进一步探讨。同时,本研究应用荧光定量RT-PCR法检测了不同时间不同浓度锌对ZIP4mRNA表达的影响,结果显示,随时间的增加,ZIP4mRNA表达随之降低,36h时降至最低值;而且随着锌浓度的增加,ZIP4mRNA的表达量亦随之下降。结果提示,前列腺癌22RV1细胞中ZIP4mRNA的表达量受外环境中锌的调控,并具有时间和剂量效应。在高锌状态下,细胞可通过减少ZIP4mRNA的表达来维持细胞内锌的稳态,而保持细胞特性。

综上所述,在一定的浓度水平,锌离子可以抑制前列腺癌细胞的增殖活性。同时在不同时间不同浓度锌离子作用下,ZIP4mRNA的表达具有时间和剂量效应,其在前列腺癌的发生发展中起何种作用,与其他锌转运体如何相互作用、共同参与锌稳态的调节尚有待进一步研究。

[1]Mao X,Kim BE,Wang F,et al.Ahistidine-rich cluster mediates the ubiquitination and degradation of the human zinc transporter,hZIP4,and protects against zinc cytotoxicity [J].JBiol Chem,2007,282(10):6992-7000.

[2]Wang K,Zhou B,Kuo YM,et al.Anovel member of a zinc transporter family is defective in acrodermatitis enteropathica [J].Am JHum Genet,2002,71(1):66-73.

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[5]Li M,Zhang Y,Bharadwaj U,et al.Down-regulation of ZIP4by RNAinterference inhibits pancreatic cancer growth and increases the survival of nude mice with pancreatic cancer xenografts[J].Clin Cancer Res,2009,15(19):5993-6001.

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(编辑 王又冬,英文编辑 陈 姜)

Effect of Zinc on the Proliferation of Prostate Cancer Cell Line 22RV1and the Expression ofZIP4mRNA

CHENQi-guang1,MADong-wei2,ZHANGZhe1,SHANGuang-yi1,KONGChui-ze1
(1.Department of Urology;2.Department of Endocrinology,The First Hospital,China Medical University,Shenyang 110001,China)

ObjectiveTo explore the effect of zinc on the proliferation of prostate cancer cell line 22RV1and the expression ofZIP4mRNA.MethodsThe morphology of 22RV1cells exposed to different concentrations of zinc was observed under phase contrast microscope,and the proliferative activity of 22RV1cells was detected by MTTassay.The effect of different concentrations of zinc on the expression ofZIP4mRNAwas determined by real-time quantitative polymerase chain reaction at different time points.ResultsIn 22RV1cells exposed to zinc of 0.5μmol/L,obvious morphological changes were found,and the proliferative activity significantly decreased compared with control group (P< 0.01).No signficant difference in the proliferative activity was found between 22RV1cells exposed to zinc of 5,50,and 100μmol/Land control group (P>0.05).The expression ofZIP4mRNAdecreased with the duration of zinc exposure and reached the lowest level after 36hours,and then the level ofZIP4mRNAmaintained.Compared with the control group,the expression ofZIP4mRNAsignificantly decreased in 22RV1cells exposed to zinc of 5,50,and 100μmol/L,except for the cells exposed to zinc of 0.5μmol/L.ConclusionWithin a certain range of concentration,zinc can inhibit the proliferation of prostate cancer cell line 22RV1,and has a time-and dose-dependent effect on the expression ofZIP4mRNA.

zinc;prostate cancer;22RV1;proliferation;ZIP4

R737.25

A

0258-4646(2010)11-0908-04

辽宁省科技计划资助项目(2007225002-1,2007216010)

陈启光(1983-),男,博士研究生.

孔垂泽,E-mail:wzhoucmu@163.com

2010-04-09

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