基质细胞衍生因子1在IgA肾病小鼠肾脏的表达及FTY720对其的影响

罗军，王紫，周建华

（华中科技大学 同济医学院附属同济医院儿科，武汉 430030）

基质细胞衍生因子1在IgA肾病小鼠肾脏的表达及FTY720对其的影响

罗军，王紫，周建华

（华中科技大学 同济医学院附属同济医院儿科，武汉 430030）

目的 探讨基质细胞衍生因子1（SDF-1）在IgA肾病小鼠的表达以及FTY720对SDF-1表达的影响。方法 30只BALB/c小鼠，随机分为3组，每组10只。IgA肾病模型组及FTY720治疗组均采用黏膜免疫复合物法造模，第9周起对FTY720组给予FTY720干预，另设正常对照组。收集实验第4、8、12周时尿液，检测尿红细胞及尿蛋白定量；第12周末处死动物留取肾脏，普通光镜及免疫荧光法检测肾脏病理改变，SABC法检测肾脏SDF-1蛋白的表达，实时定量PCR技术分析肾脏SDF-1mRNA的表达差异。结果 模型组小鼠自8周后开始出现蛋白尿，肾脏呈现典型的系膜增殖性改变，FTY720干预组蛋白尿及肾小球病变较轻。SDF-1蛋白在正常小鼠及经FTY720干预小鼠肾脏组织均呈低表达，但在模型鼠肾脏组织中呈强阳性表达。SDF-1mRNA在模型组小鼠肾脏组织中的表达较正常组有所增加，而在经FTY720干预的小鼠肾脏组织中的表达则较模型组明显减少。结论 SDF-1可能作为IgA肾病肾脏损伤及肾间质纤维化的一项指标存在。FTY720对IgA肾病具有良好的治疗效果，它可能通过影响SDF-1在肾脏的表达发挥治疗作用。

基质细胞衍生因子1；IgA肾病；FTY720；小鼠

基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是归属于CXC趋化因子家族的一种趋化因子，在肾脏可持续性表达，近年来的研究表明其与受体CXCR4所形成的SDF-1/CXCR4轴在慢性肾脏疾病的发病及进展等方面扮演重要角色，但作用机制尚未明确。FTY720是一种新合成的具有很强的免疫调节活性的免疫抑制剂，在慢性抗thy-1肾小球硬化模型及单侧输尿管梗阻模型中，可以明显抑制肾间质纤维化，延缓肾小球硬化进程［1，2］。本研究通过使用FTY720对小鼠IgA肾病模型进行干预，观察了FTY720对IgA肾病小鼠的预防及治疗效果，探讨了SDF-1在IgA肾病小鼠的表达状况以及FTY720对其的影响，以期为IgA肾病的靶向治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组和处理：BALB/c小鼠30只，雌性，体质量18～20g（华中科技大学同济医学院动物实验中心提供），随机分为正常对照组、IgA肾病模型组、FTY720治疗组，每组10只。模型组及FTY720治疗组均建立IgA肾病模型，采用隔日0.4ml 0.1%牛血清白蛋白（BSA）酸化水（6mmol/L盐酸）灌胃，第6周定时尾静脉注射1%BSA缓冲液（0.4ml/只，每日1次，连续3d），第9周起尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B，剂量为0.4mg/kg/周，每周1次，连续3周。FTY720治疗组自第9周起同时给予0.5mg/kg·d-1的FTY720水溶液灌胃，共4周，其他处理同模型组。对照组自由进食、饮水。12周末为实验终点，处死动物，收集肾脏组织备用。

1.1.2 仪器与试剂：PRISM7000HTRealTime RTPCR扩增仪（ABI公司）；FTY720（Cayman公司）；SybryGreen RealTime RT-PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；SDF-1引物（上海英骏生物技术有限公司合成）；兔抗小鼠SDF-1抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 24 h尿蛋白定量：于实验第4、8、12周末时将各组小鼠置代谢笼，收集24h尿液，采用考马斯亮蓝法检测尿蛋白定量。

1.2.2 尿红细胞计数：上述收集尿液标本同时采用定量尿沉渣计数法检测尿红细胞数。

1.2.3 肾脏常规病理学检查：小鼠处死后即留取肾皮质，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚3～4μm，常规脱蜡入水，行 HE、PAS、Masson 及 PASM染色，光镜下观察肾脏基本病理改变情况。

1.2.4 肾组织IgA免疫荧光检测：留取新鲜肾皮质标本，冰冻切片后采用FITC标记的羊抗兔IgG及兔抗小鼠IgA对肾切片行间接免疫荧光法检查。

1.2.5 免疫组织化学检测SDF-1的表达：肾脏石蜡切片，厚3～4μm，常规脱蜡并经抗原修复。一抗为兔抗小鼠SDF-1多克隆抗体，二抗为羊抗兔SABC试剂盒，采用SABC法检测肾组织中SDF-1的表达，阳性部位呈棕黄色。

1.2.6 定量PCR技术检测肾脏SDF-1mRNA的表达：提取肾组织中的总RNA，逆转录合成cDNA，采用Realtime RT-PCRSybryGreen染料法对组织中SDF-1模板进行扩增，并使用2-ΔΔCt法计算初始mRNA的相对值，分析基因表达差异。管家基因GAPDH作为组内参基因，各样本的ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），ΔΔCt=ΔCt（目标组）-ΔCt（对照组）。SDF-1引物序列：5′GCTCTGCATCAGTGACGG3′（正义链），5′TAATTACGGGTCAATGCACA3′（反义链）。GAPDH引物序列：5′CTGCACCACCAACTGCTTAG3′（正义链），5′GATGGCATGGACTGTGGTCAT3′（反义链）。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件包行t检验，计量资料数据用±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 24h尿蛋白定量检测及血尿检测结果

各组小鼠尿蛋白定量于观察第4周末时未见统计学差异，自8周末始模型组小鼠尿蛋白较正常对照组开始增加，12周末时达高峰；经FTY720干预的小鼠尿蛋白定量于8周末及12周末时均增加，但低于模型组，且差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。实验周期内各组小鼠均未见肉眼血尿，模型组小鼠可见8例（80%）镜下血尿，FTY720治疗组可见3例（30%）镜下血尿，对照组各期均未见血尿。

表1各组小鼠24h尿蛋白定量（n=10，mg/24h，±s）Ta b.124-h o u r u r i n ep r o t e i ni nmi c eo f e a c hg r o u p（n=10，mg/24h，±s）Group Week 4 Week 8 Week 12Control 0.79±0.06 0.87±0.07 0.81±0.071）IgANmodel 0.87±0.09 1.16±0.11 2.07±0.17FTY720 0.89±0.07 1.12±0.14 1.35±0.111）1）P＜ 0.05vs IgANmodel group.

2.2 肾组织常规病理学检测结果

正常组小鼠肾小球均未见明显变化，模型鼠呈现典型的系膜增生性肾炎病变，系膜基质多呈中重度增生，部分肾小球肥大，肾小囊上皮细胞小管样化生，并可见球囊粘连。FTY720治疗组肾小球系膜增殖性改变明显较轻。见图1。

2.3 肾组织IgA免疫荧光检测结果

新鲜肾皮质标本冰冻切片后，采用FITC标记的羊抗兔IgG及兔抗小鼠IgA对肾切片行间接免疫荧光法检查，可见模型组及FTY720治疗组IgA呈团块状沉积于系膜区，模型组荧光强度达（++++）。

2.4 肾组织中SDF-1免疫组化检测结果（图2）

SDF-1蛋白在正常小鼠肾脏组织中呈低表达状态，在模型组肾脏组织中呈强阳性表达，在经FTY720干预小鼠肾脏组织呈低表达。正常小鼠及FTY720干预小鼠肾脏组织中SDF-1蛋白阳性表达主要出现在肾小管上皮细胞，模型组肾小球亦可见少量表达，而在各组小鼠肾间质均缺乏表达。

2.5 肾组织中SDF-1mRNA检测结果

令正常对照组小鼠肾脏组织中SDF-1的初始模板基因表达量为1，使用2-ΔΔCt法计算出模型组及FTY720处理组小鼠肾脏SDF-1的初始模板相对表达平均值分别为1.54及1.07（表2）。可见SDF-1mRNA在模型组小鼠肾脏组织中的表达较正常组有显著增加（P＜0.05），而在经FTY720干预的小鼠肾脏组织中的表达则较模型组明显减少（P＜0.05）。

表2各组小鼠SDF-1初始模板基因相对表达量（n=10，±s）Ta b.2Re l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l o fSDF-1mRNAi n mo u s e k i d n e y（n=10，±s）Group ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCt Control 4.86±0.26 0 1IgANmodel 4.24±0.34 －0.62±0.08 1.54±0.181）FTY720 4.76±0.35 -0.10±0.05 1.07±0.162）1）P＜0.05vs control group；2）P＜0.05vs IgANmodel group.

3 讨论

本研究参照经典方法制做小鼠IgA肾病模型［3，4］，结果出现典型的蛋白尿及IgA肾病病理改变，说明模型制作较为成功。与此同时，本研究通过免疫组化技术检测了SDF-1蛋白在各组小鼠肾脏的表达，发现SDF-1在正常小鼠肾小管上皮细胞呈低表达状态，在模型组肾小管则呈强阳性表达，而在肾间质各组小鼠均缺乏阳性表达，这与Loten［5］用免疫组织化学检测IgA肾病患者肾脏SDF-1表达的结果相似。通过荧光实时定量PCR技术，本研究进一步发现模型组小鼠SDF-1mRNA在肾脏中的表达增加，与免疫组化检测结果吻合，与国内外一些学者对其他慢性肾脏疾病如狼疮性肾炎、慢性缺氧导致肾硬变等的研究结果相似［6，7］。Gao［8］在动物模型中发现同种肾移植后12周，单用环孢素A组的SDF-1水平是用环孢素A+抗SDF-1抗体组的2倍，是正常对照的4倍，故推测SDF-1是慢性肾脏疾病肾脏损伤程度的一项指标，SDF-1表达越高，肾脏损伤程度越重。

本研究中采用FTY720进行干预的小鼠蛋白尿及病理改变均较模型组小鼠明显减轻。此外，在经FTY720干预的小鼠肾脏组织中，SDF-1蛋白仅有微量表达；荧光实时定量PCR技术亦证实SDF-1mRNA在肾脏的表达较模型组小鼠有明显减少。目前一般认为FTY720主要通过非选择性作用于淋巴细胞表面的1-磷酸鞘氨醇受体，将淋巴细胞阻滞在次级淋巴器官，使其不能加入全身循环而发挥其免疫抑制效应［9］。由于SDF-1是淋巴细胞的强趋化因子，在肾脏表达增高可以驱动淋巴细胞包括IgA分泌细胞向肾脏分布，最终导致肾脏局部的炎性反应和损伤。

本研究结果表明，FTY720对小鼠IgA肾病具有良好的预防及治疗效果，它可能通过上述机制发挥作用，同时也可能因减少趋化因子SDF-1在肾脏的表达，进而影响相关黏附分子的表达以及相互作用，最终进一步减少淋巴细胞向小管间质的浸润，减轻淋巴细胞所分泌的淋巴因子和炎性介质对肾脏组织的损伤，延缓了肾脏纤维化的进程，从而达到治疗作用。而FTY720如何作用于趋化因子SDF-1，以及与其他相关黏附分子相互作用关系亦有待进一步研究。

综上所述，FTY720的治疗作用可能通过减少SDF-1在肾脏的表达而发挥，以SDF-l/CXCR4为靶向的研究将可能为IgA肾病及其他慢性肾脏病的治疗提供新的思路。

［1］Peters H，Martini S，Wang Y，et al.Selective lymphocyte inhibition by FTY720slows the progressie course of chronic anti-thy1glomerulosclerosis［J］.Kidney Int，2004，66（4）：1434-1443.

［2］谢敏，周建华.FTY720对大鼠肾间质纤维化的抑制作用［J］.华中科技大学学报（医学版），2007，36（6）：751-755.

［3］刘志红，黎磊石，李莉.葡萄球菌肠毒素诱发的IgA肾病模型［J］.中华肾脏病杂志，1989，5（1）：6-10.

［4］刘宏伟，卢景芬，李彩熙，等.滋肾止血片对实验性IgA肾病小鼠肾组织氧自由基的影响［J］.中国中医基础医学杂志，1996，2（6）：24-26.

［5］Lotan D，Sheinberg N，Kopolovic J，et a1.Expression of SDF-1/CXCR4in injuried human kidneys［J］.Ped Nephrol，2008，23（1）：71-77.

［6］Chong BF，Mohan C.Targeting the CXCR4/CXCL12axis in systemic lupus erythematosus［J］.Expert Opin Ther Targets，2009，13（10）：1147-1153.

［7］Kretzler M，Grne HJ，Schlndorff D，et a1.Human nephrosclerosis triggers a hypoxia-related glomerulopathy［J］.Am JPathol，2009Dec 17.［Epub ahead of print］

［8］Gao C，Huan J.SDF-1plays a key role in chronic allograft nephropathy in rats［J］.Transplant Proc，2008，40（5）：1674-1678.

［9］Chiba K，Yanagawa Y，Masubuchi Y，et a1.FTY720，a novel immunosuppres-sant，induces sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats.1.FTY720selective lydecreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing［J］.JImmunol，1998，160（10）：5037-5044.

（编辑 王又冬，英文编辑 陈 姜）

Effect of FTY720on the Expression of Stromal Cell-derived Factor-1in Mouse Model of IgANephropathy

LUOJun，WANGZi，ZHOUJian-hua
（Department of Pediatrics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

ObjectiveTo study the effect of FTY720on the expression of stromal cell-derived factor-1（SDF-1）in mouse model of IgAnephropathy （IgAN）.MethodsAtotal of 30female BALB/c mice were randomly divided into 3groups （n=10each group）：control group，IgANmodel group，and FTY720group.The 24-hour urine protein was quantified by coomassie brilliant blue at weeks 4，8，and 12.All the mice were killed after 12weeks，and the kidneys were sampled.The pathological changes in the kidney were observed under light microscope and detected by immunofluorescence.The levels of SDF-1protein and mRNAin the kidney were detected by SABCimmunohistochemical method and real-time reverse transcription polymerase chain reaction，respectively.ResultsProteinuria and mesangial cell proliferation were observed in IgANmodel group since week 8，and these pathological changes were less severe in FTY720group.The expression level of SDF-1protein was low in control and FTY720groups，but strongly positive expression of SDF-1protein was found in IgANgroup.The expression ofSDF-1mRNAin IgANmodel group increased，compared with control group.The expression ofSDF-1mRNAwas lower in FTY720group than in IgANmodel group.ConclusionSDF-1might be an indicator of renal injury and fibrosis of IgAN.FTY720has a good therapeutic effect on IgANby affecting the expression ofSDF-1in the kidney.

stromal cell-derived factor-1；IgAnephropathy；FTY720；mouse

R692.6

A

0258-4646（2010）11-0895-03

国家自然科学基金资助项目（30872797）

罗军（1973-），男，主治医师，博士研究生.

周建华，E-mail：jhzhou@tjh.tjmu.edu.cn

2010-08-03

·论著·