淡豆豉提取物对去卵巢骨质疏松大鼠骨微细结构的改善作用

牛丽颖， 王鑫国， 任艳青， 刘 姣， 李 清

(河北医科大学中医学院河北省实验动物重点实验室，河北石家庄050091)

近年来植物雌激素对绝经后妇女骨质疏松症的防治备受关注。研究发现，中药淡豆豉有明显的抗骨质疏松活性［1，2］，但其对骨质疏松模型动物骨微细结构的影响目前尚未见报道。本研究采用大鼠去卵巢的方法模拟妇女绝经后骨质疏松，通过观察淡豆豉提取物对骨质疏松大鼠骨微细结构的影响，以进一步明确其对骨质疏松的防治作用，为开发淡豆豉资源提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 淡豆豉，由本实验室在《中国药典》(2005版)淡豆豉制法的基础上，对其工艺参数进行量化、优选后炮制而成，成品经石油醚(60～90℃)脱脂、8倍量70%乙醇回流提取(3次，每次2 h)、大孔树脂纯化，流出液浓缩至4 g生药/mL，备用;仙灵骨葆胶囊，贵州同济堂制药有限公司。

1.1.2 仪器 Reicheit-Jung 2040切片机(德国);Leica Qwin图象分析系统(德国);Olympus显微镜(日本);Opton荧光显微镜(德国)。

1.1.3 动物 SD大鼠，♀性，6月龄，由河北省实验动物中心提供，动物饲料亦由该中心提供;各组大鼠分笼饲养，饲养条件:光照12 h，黑暗12 h，室温20～24℃，相对湿度40% ～70%，自由饮水、摄食。

1.2 方法

将大鼠麻醉后无菌条件下切除双侧卵巢，假手术组只将卵巢和输卵管牵引体外，然后再将其返回原处即可，不切除卵巢［3］。术后1周，将手术成功的大鼠按体重分为分为去卵巢模型组、淡豆豉提取物低剂量组(5 g生药/kg·d)、淡豆豉提取物中剂量组(10 g生药/kg·d)、淡豆豉提取物高剂量组(20 g生药/kg·d)及阳性药仙灵骨葆组(0.5 g/kg·d)，每组8只。各组大鼠每天上午灌胃给药，给药容量为10 mL/kg，假手术组及去卵巢模型组大鼠给予等容量蒸馏水，连续12周。各组动物于处死前16 d和前3 d分别腹腔注射盐酸四环素30 mg/kg体重，以对骨进行荧光标记。末次给药后，处死大鼠，取左侧胫骨近端1/3，将胫骨切成5 μm的纵向不脱钙骨切片，置于荧光显微镜下观察或甲苯胺蓝染色后观察，采用Leica Qwin图象分析系统进行骨组织形态计量［4］。各参数如下:①骨小梁组织形态计量:骨小梁体积百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、活性生成表面百分比(AFS%)、骨小梁矿化率(MAR)、骨小梁骨生成率(BFR)。② 皮质内表面形态计量:类骨质平均宽度(OSW)、骨皮质矿化率(mAR)。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对去卵巢大鼠胫骨骨量参数TBV%和骨吸收参数TRS%的影响

去卵巢模型组大鼠骨量参数TBV%较假手术组大鼠明显降低(P＜0.01)，骨吸收参数TRS%较假手术组大鼠明显升高(P＜0.01);淡豆豉提取物各剂量组大鼠TBV%较去卵巢模型组大鼠明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，TRS%明显降低(P＜0.01)，见表1。

表1 淡豆豉提取物对去卵巢大鼠胫骨TBV%和TRS%的影响(¯x±s)

2.2 对去卵巢大鼠胫骨形成参数TFS%、AFS%、MAR和BFR的影响

去卵巢模型组大鼠TFS%、AFS%、MAR和BFR均较假手术组大鼠明显升高(P＜0.01);淡豆豉提取物(20 g生药/kg)组大鼠TFS%、AFS%较去卵巢模型组大鼠明显降低(P＜0.05);各剂量的淡豆豉提取物均可不同程度地降低大鼠MAR、BFR水平(P＜0.05或P＜0.01)，见表2。

表2 淡豆豉提取物对去卵巢大鼠胫骨TFS%、AFS%、MAR和BFR的影响(±s，n=8)

表2 淡豆豉提取物对去卵巢大鼠胫骨TFS%、AFS%、MAR和BFR的影响(±s，n=8)

注:与去卵巢模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂 量(g生药/kg) TFS/% AFS/% MAR/(μm/d) BFR/(μm/d)假手术组 — 8.72±1.94** 8.94±2.07** 0.94±0.14** 7.65±2.31**去卵巢模型组 — 14.46±4.05 15.56±4.66 3.26±1.38 41.42±6.46淡豆豉提取物组 5 12.38±3.35 14.34±2.58 1.76±0.62* 20.27±5.14**10 10.82±2.86 14.96±2.82 1.58±0.22** 20.56±4.41**20 10.36±1.96* 11.06±2.86* 2.01±0.34* 22.16±4.55**仙灵骨葆组 0.5 10.71±2.05* 10.45±2.63* 1.56±0.25** 16.37±3.27**

2.3 对去卵巢大鼠胫骨OSW、mAR的影响

去卵巢模型组大鼠OSW、mAR较假手术组大鼠明显升高(P＜0.01);去卵巢模型组比较，淡豆豉提取物(20 g生药/kg)组OSW明显降低(P＜0.01)，淡豆豉提取物(10 g生药/kg、20 g生药/kg)组mAR明显降低(P＜0.05)，见表3。

3 讨论

中医并无骨质疏松病名，但“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”、“骨极”的描述与骨质疏松极为相似。中医认为:“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，肾之所合也;髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强。”骨的生长发育与肾精盛衰关系密切，肾精充足则骨髓生化有源、骨骼得以滋养而强健有力;肾精亏虚则骨髓生化无源、骨骼失养而痿弱无力。妇女绝经后，肾气渐衰，肾精虚少，骨髓化源不足，不能营养骨骼，进而导致骨骼脆弱无力，出现腰脊酸软疼痛，下肢乏力，遇外力易发生骨折等骨质疏松症状，可见，中医的肾虚是绝经后骨质疏松症的主要病理生理学基础［5］。

表3 淡豆豉提取物对去卵巢大鼠胫骨OSW、mAR的影响(±s)

表3 淡豆豉提取物对去卵巢大鼠胫骨OSW、mAR的影响(±s)

注:与去卵巢模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂 量/(g生药/kg) 动物数/只 OSW/μm mAR/(μm/d)假手术组 — 8 7.76±1.68** 2.01±0.81**去卵巢模型组 — 8 12.38±2.67 3.26±0.64淡豆豉提取物组 5 8 10.16±1.36 2.64±0.55 10 8 10.84±2.14 2.51±0.61*20 8 8.35±2.01** 2.56±0.34*仙灵骨葆组 0.5 8 9.74±1.43* 2.46±0.46*

现代研究认为，绝经后妇女骨质疏松(postmenopausal osteoporosis，PMO)主要是由于雌激素水平下降，破骨细胞所介导的骨吸收增加，骨量减少、骨组织显微结构退化，以致骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身性骨病。骨强度既与骨量有关，又与骨的内部结构有关。在骨质疏松发生过程中，骨结构的变化首先表现为骨小梁变细，随着病程的发展，骨小梁穿孔、断裂，最终导致骨小梁数量减少，连接减少，游离端增多骨的微观结构退化甚至破坏，这是骨的生物力学性能减退，容易发生骨质疏松性骨折的重要原因。Hahn等［6］认为，骨量并不能完全反映松质骨的稳定性和力学强度，骨结构的减退对骨的整体性能往往更具危害性。增加骨小梁数目、保护骨的微细结构是治疗骨质疏松的重要目的之一。骨形态计量学是对骨结构进行定量分析的重要手段。它能从组织学上，对骨的成分进行分析，可以提供成骨细胞、破骨细胞的活性、骨量的改变以及骨转换率、骨结构的形态与数值信息，判断骨重建的状况。通过进行四环素荧光物质标记，还可以对骨矿代谢和骨形成过程进行定量分析。

去卵巢模型现已成为研究绝经后骨质疏松的经典动物模型，本实验结果表明:大鼠切除卵巢3个月后，作为骨量主要标志的胫骨TBV%显著降低，而代表骨吸收参数的TRS%以及代表骨形成参数的TFS%、AFS%、MAR、BFR、OSW 和 mAR 皆显著增高，成功地模拟了绝经后高转换型骨质疏松模型，这一结果与大量的国内外文献报道相一致［7］。给去卵巢大鼠灌服淡豆豉提取物12周后能使上述指标发生逆转，骨的空间微细结构得以改善，对去卵巢大鼠骨质疏松有一定的防治作用。淡豆豉的生物活性成分主要为大豆异黄酮，大豆异黄酮的生物活性主要体现在4种主要单体组分上，即染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元，大豆异黄酮在结构和功能上与雌激素有相似之处，因此被认为是植物雌激素。当人体内雌激素水平低时，植物异黄酮占据雌激素受体，发挥弱雌激素效应［8］，也有研究提示大豆苷元比大豆苷能更有效地预防去卵巢大鼠骨丢失［9］，本课题组前期研究也发现大豆经炮制后大豆苷元含量明显增加［10］，由此推测淡豆豉可能比大豆具有更强的抗骨质疏松作用，进一步的研究仍在进行中。

［1］李 双，牛丽颖，窦玉红，等.淡豆豉对去卵巢骨质疏松大鼠骨生物力学性能的影响［J］.中药药理与临床，2008，24(2):57-58.

［2］毛俊琴，李铁军，黄晓瑾.中药淡豆豉防治去卵巢大鼠骨质疏松的实验研究［J］.解放军药学学报，2006，22(2):136-138.

［3］徐叔云，卞如濂，陈修，等.药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1992:1286.

［4］谢雁鸣，鞠大宏，赵晋宁.骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠骨密度和骨组织形态计量学影响［J］.中国中药杂志，2004，29(4):343-345.

［5］牛丽颖，王鑫国，李 清，等.乌鸡白凤丸对去卵巢骨质疏松大鼠骨形态计量学参数的影响［J］.中成药，2009，31(4):527-529.

［6］Hahn M，Vogel M，Pompesius KM，et al.Trabecular bone pattern factor:A new parameter for simple quantification of bone microarchitecture［J］.Bone，1992;13:327-333.

［7］Wronski TJ.Histologic evidence for osteopenia increased bone turnover in ovariectomiced rats［J］.Bone，1986，7:119-123.

［8］Shutt DA.Cox steroid and phyto-ostrogen bnding to sheep uterine receptors invitro［J］.Jendoer，1972，52:299-310.

［9］Picherit C，Coxam V，Bennetau-Pelissero C，et al.Daidzein is more efficient than genistein in preventing ovariectomy-induced bone loss in rats［J］.J Nutr，2000，130:1675-1681.

［10］牛丽颖，杜红娜，刘 姣，等.淡豆豉炮制前后异黄酮组分含量的比较研究［J］.大豆科学，2008，27(4):672-678.