复方鸡血藤膏的质量标准研究

吴 融， 卢 燕， 陈道峰

(复旦大学药学院生药学教研室，上海201203)

复方鸡血藤膏为一传统的妇科良药，始创于清道光年间，现收载于《中国药典》(2005年版一部)，由滇鸡血藤膏粉(218.75 g)、川牛膝(59.5 g)、续断(53 g)、红花(5 g)和黑豆(12.5 g)配伍，以糯米(437.5 g)、饴糖(300 g)为辅料制成，功能补血、活血、调经，用于血虚、手足麻木、关节酸痛和月经不调等症。由于基础研究薄弱，现行药典中复方鸡血藤膏项下仅规定了制剂性状及专属性很差的香豆素类、酚类化合物的显色反应，缺乏方中各味药的特征性鉴别和指标成分的含量测定［1］。方中君药滇鸡血藤膏粉为滇鸡血藤(木兰科内南五味子Kadsura interior A.C.Smith的藤茎)的水提干浸膏粉，处方剂量约为其他四味药原药材总量的2倍，是复方鸡血藤膏质量控制研究的重点。我们的前期研究发现，联苯环辛烯类木脂素是滇鸡血藤的主要活性成分，其中异型南五味子丁素(heteroclitin D)含量高、活性强，具有抗氧化、钙拮抗、抑制血小板聚集等与药材传统功效一致的药理作用，可作为滇鸡血藤及其复方制剂质量控制的指标成分［2-5］。为了有效鉴别和质量控制，本实验建立了制剂中滇鸡血藤、川牛膝和续断三味主药的特征性TLC鉴别方法，并采用HPLC方法建立了异型南五味子丁素的含量测定方法，为完善复方鸡血藤膏这一传统中药制剂的质量标准提供了参考依据。

1 仪器与试药

Agilent HP1100型高效液相色谱仪，DAD检测器;SHANGPING FA1004天平(上海天平仪器厂);ZX-91旋转蒸发仪(中国科学院上海有机化学所);电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂);DHG型电热恒温鼓风干燥箱(上海华连医疗器械有限公司);DL-360超声波清洗器(上海之信仪器有限公司);硅胶GF254、硅胶G薄层板(烟台市芝罘黄务硅胶试验厂);HPLC测定用甲醇、乙腈为色谱纯，水为市售纯净水;其他试剂均为分析纯。

对照品异型南五味子丁素(丁素)为自制，经IR、MS、1HNMR、13CNMR 确定其化学结构，纯度经HPLC-ELSD法测定大于98%;川牛膝对照药材(1065-200002)、续断对照药材(121033-200306)购于中国药品生物制品检定所;8批复方鸡血藤膏样品 (20031201，20050601，20050801，20060919，20061101，20070106，20070701，20080301)和滇鸡血藤对照药材由云南广福药业有限公司提供，对照药材经鉴定为内南五味子K.interior A.C.Smith的藤茎。

TLC鉴别用阴性对照样品照《中国药典》(2005年版一部)规定的复方鸡血藤膏相同工艺按处方量1/20取样自制;其中滇鸡血藤膏粉为内南五味子K.interior的干燥藤茎经加工制成的浸膏粉，由云南广福药业有限公司提供;川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis kuan的干燥根，续断为川续断科植物川续断Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根，红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，黑豆为豆科植物大豆Clycine max(L.)Merr.的干燥的黑色种子，该四味药材均购自上海华宇药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 TLC定性鉴别

2.1.1 滇鸡血藤的TLC鉴别 取本品粉末5 g，加热水50 mL溶解，放冷，取上清液用乙酸乙酯振摇提取3次，每次50 mL，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，残渣加乙酸乙酯0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺滇鸡血藤的复方鸡血藤膏阴性对照样品5 g，同法制成阴性对照溶液。另取滇鸡血藤对照药材2 g，加热水50 mL，同法制成对照药材溶液。再取异型南五味子丁素对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(2 ∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照色谱无干扰。结果见图1。

图1 滇鸡血藤的TLC鉴别图谱

2.1.2 川牛膝的TLC鉴别 取本品粉末5 g，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，加水10 mL溶解，用乙醚振摇提取2次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺川牛膝的复方鸡血藤膏阴性对照样品5 g，同法制成阴性对照溶液。另取川牛膝对照药材0.2 g，加甲醇10 mL，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(3∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照色谱无干扰。结果见图2。

图2 川牛膝的TLC鉴别图谱

2.1.3 续断的TLC鉴别 取本品粉末5 g，加甲醇50 mL超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺续断的复方鸡血藤膏阴性对照样品5 g，同法制成阴性对照溶液。另取续断对照药材0.2 g，加甲醇10 mL，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，加热至显色明显。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的淡紫红色斑点，阴性对照色谱无干扰。结果见图3。

2.2 HPLC含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:YMC ODS-H80 4 μm(250 mm×4.6 mm ID);预柱:Phenomenex C18(4 mm L×3.0 mm ID);流动相为甲醇-乙腈-水(10 ∶48∶42);流速:1 mL/min;柱温:35℃;检测波长:230 nm。在此色谱条件下，异型南五味子丁素峰与前后峰分离度大于1.5，理论板数大于10 000，溶剂峰、阴性对照均无干扰，结果见图4。

图3 续断的TLC鉴别图谱

图4 复方鸡血藤膏HPLC色谱图

2.2.2 线性关系考察 取异型南五味子丁素对照品，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.144 mg的溶液，作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液5、7、10、20、50、100、200 μL，分别加甲醇稀释定容至 1 mL，作为对照品稀释液。精密吸取上述稀释液各20 μL，进样，以峰面积 A对进样浓度 C(μg/mL)求得线性回归方程。结果表明丁素在0.72 μg/mL～28.8 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为 A=6.64×104C－0.104，相关系数为0.999。

2.2.3 供试品及阴性对照溶液的制备 取本品研细，过五号筛，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入环己烷50 mL，密塞，称定重量，超声处理50 min，放冷，再称定重量，用环己烷补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。精密称取缺滇鸡血藤的复方鸡血藤膏阴性对照样品粉末0.5 g，同法制成阴性对照溶液。

2.2.4 检测限和定量限考察 采用信噪比法，进空白溶剂后，测出噪音，进已知浓度的对照品，根据其对应的峰高值，将对照品溶液稀释至约3、10倍信噪比高度的浓度，即为检测限与定量限。所得检测限为7.2×10－8g/mL;定量限为2.74×10－7g/mL(n=6，RSD值为2.7%)。

2.2.5 精密度试验 取同一份对照品溶液(对照品贮备液稀释50倍)，按2.2.1项下色谱条件连续进样6次，每次20 μL，异型南五味子丁素峰面积的RSD值为2.2%;取批号为20070106的样品粉末(过五号筛)，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，丁素峰面积RSD值为1.0%，表明方法精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取2.2.5项下同一供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8、12 h 及1、2、3、4、5、6 d 进样，每次20 μL，计算异型南五味子丁素含量，结果显示同一天12 h内丁素含量的RSD值为1.2%，6 d内RSD值为2.0%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取批号为20070106的样品粉末(过五号筛)，按2.2.3项下方法，平行制备6份供试品溶液，测定异型南五味子丁素的含量，平均含量为33.2 μg/g，RSD值为2.8%，表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密吸取浓度为0.144 mg/mL的对照品溶液60 μL，加至具塞锥形瓶中，共6份;于水浴上蒸干后，取批号为20070106的样品粉末(过五号筛)6份，每份约0.25 g，精密称定，加入上述具塞锥形瓶中，按2.2.3项下方法，平行制备6份供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定异型南五味子丁素的含量，计算加样回收率，结果见表1。平均加样回收率为101.9%，RSD值为2.8%。

2.2.9 耐用性考察 采用3根不同厂家的色谱柱按2.2.1项下色谱条件对同一供试品溶液进行分离，并计算异型南五味子丁素的含量，结果见表2。3根色谱柱的测定结果无明显差异，RSD值为0.29%，表明方法耐用性良好。

表1 复方鸡血藤膏中异型南五味子丁素含量测定的加样回收率实验结果

表2 不同型号色谱柱的耐用性试验

2.2.10 异型南五味子丁素的含量测定 精密吸取对照品贮备液5 μL、50 μL，分别用甲醇稀释定容至1 mL，作为随行对照品溶液。取各批次复方鸡血藤膏样品，按2.2.3项下方法，制备供试品溶液。分别精密吸取随行对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定异型南五味子丁素的含量，并按干燥品计算样品的异型南五味子丁素含量(结果见表3)。

表3 复方鸡血藤膏中异型南五味子丁素的含量测定结果(n=2)

3 讨论

3.1 除内南五味子外，同属植物异型南五味子K.heteroclita(Roxb.)Craib和五味子属植物铁箍散Schisandra propinqua(Wall.)Bail var.intermedia A.C.Smith的藤茎在民间均作为熬制“滇鸡血藤膏”的原料［6］，但以内南五味子品质好、产量大。为了保证质量的稳定性，本实验建立的滇鸡血藤TLC鉴别方法同时以活性成分异型南五味子丁素和内南五味子藤茎为对照，特征明显、专属性强。由于川牛膝、续断活性成分不明确，这两味药的TLC鉴别仅采用对照药材为对照。经验证，本实验所建立的三味主药的TLC鉴别方法对于温度、湿度和不同厂家薄层板均有良好的耐用性。

3.2 滇鸡血藤中活性木脂素类成分结构复杂多样，水溶性较低，木脂素类成分HPLC分析常用的甲醇-水或乙腈-水很难在短时间内将异型南五味子丁素与其他成分完全分离，本实验经多次条件优化确定了甲醇-乙腈-水(10 ∶48 ∶42)的流动相组成，丁素峰的分离度大于1.5，保留时间25 min左右，并根据文献［7-8］的研究结果，采用环己烷为提取溶剂，通过对提取方法、提取时间和溶剂用量的考察，最终确定了供试品溶液的制备方法。

3.3 对8批复方鸡血藤膏样品进行了干燥失重检查，各批样品的减失重量为7.73% ～11.76%，符合《中国药典》2005年版复方鸡血藤膏项下规定。为了增加数据的可比性，以干燥品计算了各批样品中的异性南五味子丁素含量，结果见表3。

3.4 HPLC含量测定结果显示，8批复方鸡血藤膏中丁素含量差异较大，说明采用现行药典标准中简单的性状和化学反应定性鉴别难以控制质量和药效的稳定性。滇鸡血藤膏粉传统的水提制备工艺对丁素等木脂素类有效成分的提取率较低(采用本实验的HPLC方法测定，丁素含量仅为0.001 7%-0.028%)，加上辅料糯米和饴糖的大量应用(总膏量的70%以上)，造成复方鸡血藤膏中丁素含量很低，本实验所测的8批样品中含量最高的以干燥品计也不到0.005 0%。另外，复方鸡血藤膏剂型落后，需用水、酒各半炖化服用，非常不方便。因此，需要对复方鸡血藤膏进行制备工艺和剂型改良，以利于提高原料利用率、减小用量和便于服用，更好地发挥这一古老制剂的独特疗效。

［1］中国药典［S］.一部.2005:531.

［2］Chen Daofeng，Xu Guojun，Yang Xiuwei，et al.Dibenzocyclo-octadiene lignans from Kadsura heteroclita ［J］.Phytochemistry，1992，31(2):629-632.

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［4］蒋仕丽，张蕴毅，陈道峰.异型南五味子丁素、五味子酚和(+)安五脂素对血小板聚集的影响［J］.复旦学报:医学版，2005，32(4):96-100.

［5］Lu Yan，Chen Daofeng.Kadsutherin D.A new dibenzocyclooctadiene lignan from Kadsura Species［J］.Nat Prod Res，2008，22(15):1344-1349.

［6］徐国钧，徐珞姗.常用中药材品种整理和质量研究(南方协作组第二册)［M］.福州:福建科学技术出版社，1997:521-576.

［7］司徒冰，陈道峰，郁韵秋.异型南五味子木脂素的HPLC法测定［J］. 中草药，1996，27(8):465-466.

［8］郁韵秋，陈道峰，司徒冰.高效液相色谱法测定内南五味子的木脂素含量［J］.药物分析杂志，1996，16(5):313-316.