断血流皂苷A血浆浓度的自动柱切换高效液相色谱法测定

陈娇婷， 詹怡飞， 王跃生

(1.赣南医学院药学院，江西赣州341000;2.湖州营养与健康产业创新中心，浙江 湖州313000;3.国家中药固体制剂工程中心，江西南昌330000)

断血流皂苷A(clinopodiside A)为中药断血流的主要成分，具有止血功效［1］，属于齐墩果烷型三萜皂苷类，含量较高，且化学性质稳定。

柱切换技术采用切换阀连接2根或2根以上相同或不同分离机理的色谱柱，通过改变流动相走向，在前一根色谱柱完成被测组份与干扰杂质的分离，达到纯化与富集的目的，在随后的色谱柱完成被测组份的测定。因此，该技术可实现对复杂样品的直接进样分析，基本克服了以往样品前处理复杂、繁琐且耗费试剂、人工等缺点，使得该技术在分析含量低、干扰大、检测困难的复杂样品时显示出巨大的优越性。同时，该技术可实现柱前、柱后、痕量富集及制备等操作，并易于实现自动化操作［2，3，4］。本实验建立断血流皂苷A血浆浓度的柱切换高效液相色谱测定方法。为今后阐明断血流皂苷A的体内药代动力学行为、新药研发以及相关制剂研究提供指导和依据。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

Agilent公司1100系列高效液相色谱仪(包括DAD检测器);FCV-2A高压切换阀;高速离心机(上海安宁科学仪器公司);BSZ-2型自动双重水蒸馏系统(上海博通);SartoriusBP221S型电子天平(美国Sartorius公司);TG328B型析天平(万分之一天平)(上海天平仪器厂)。

断血流皂苷A对照品(中国药品生物制品检定所)，甲醇为色谱纯，水为三重蒸馏水(自制)，其余试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 预处理柱(简称PC):大连装Kromasil C18(20 mm ×4 mm，5 μm);预处理流动相(简称 PMP):甲醇-水;预处理流动相流速:1.0 mL/min;分析柱(简称AC):Lichrospher 100 RP-18e(250 mm ×4 mm，5 μm);分析流动相(简称 AMP):甲醇-0.01 mol/mL磷酸盐缓冲液(磷酸调pH=3.0)(60∶40);分析流动相流速:0.6 mL/min;分析柱柱温:45℃;检测波长:250 nm。

2.1 色谱行为 样品的CSHPLC分析图谱见图1，断血流皂苷A保留时间约为7 min，血浆内源性杂质干扰较小，样品峰形良好。

物业管理公司部门错综复杂，对于成本的管理上比较困难，往往需要建立完善的管理机制，同时对工作中的细节也不能忽视。具体来说，造成物业管理公司成本的来源多，管理困难，这就要求对公司的成本管理设计要从根本上进行，除了对制度和政策上成本的控制外，还要对物业管理过程中产生的细节成本进行具体研究，改进细节成本管理的不足，把微小工作中产生的成本降到最低。

2.5 样品稳定性试验 取一定量(高、中、低3种浓度)断血流皂苷A对照品大鼠血浆样品，分别进行样品处理液稳定性试验:进样条件下样品处理液在5℃放置0、4、10、20、40 h进样分析;样品冷冻放置稳定性试验:-20℃冷冻储藏，分别放置0、6、20、40 d后按1.2.3项下样品处理步骤处理进样分析;室温放置稳定性试验:室温放置0、1、2、4 h后按1.2.3项下样品处理步骤处理进样分析。所用测定结果准确度均在89～112%范围内，RSD均＜5%，断血流皂苷A在上述条件下均稳定性良好。

2.3 日内和日间精密度 取一定量(高、中、低3种浓度)断血流皂苷A对照品大鼠血浆液，按1.2.3项下样品处理步骤处理，采用断血流皂苷A血浆柱切换高效液相色谱法测定，在1 d内连续测定6次，得日内精密度 RSD分别为1.22%，0.81%和0.39%(n=6);连续3 d测定，测得各浓度的日间精密度RSD分别为:1.67%、0.74%和0.45%(n=6)。

1.2.2 对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的断血流皂苷A对照品7.5 mg，置25 mL量瓶中，用分析流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得含断血流皂苷A为0.3 mg/mL的对照品溶液。

2 结果

图论问题在18世纪初期就已经开始有运用，由于现代计算机的出现，图论的应用则越来越广泛，包括结构化学、计算机网络以及数学竞赛等。使用图论可以提供给我们一个快速解决问题的方式和角度。数学题中应用题相对偏多，而应用题往往都是在实际背景下产生出来的题型，在数学竞赛中是一种相对比较重要且难度较大的题型，主要考查学生如何通过数学相关的知识来解决和分析实际问题的能力，而这个能力则是通过解决数学图论的能力来展现。

结果表明断血流皂苷A在15～45 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.2 线性关系 取空白大鼠血清1 mL，加入上述对照品溶液 0.5，0.7，0.9，1.1，1.3，1.5 mL，置于 10 mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，得到浓度为 0.015，0.021，0.027，0.033，0.039，0.045 mg/mL的系列对照品溶液。按照1.2.3项下样品处理步骤制备成对照品溶液，在拟定色谱条件下精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量(x，μg)对峰面积进行线性回归，得方程为:Y=0.3113x-0.0441(r=0.999 5)。

高中电磁学反映的是电场与磁场的相互作用关系，揭示的是物理宏观世界的本质规律，抽象的概念与规律缺乏表象基础，注重外部表面特征和非本质联系的高中学生对于可见度不高的电磁现象及电磁规律显得很茫然。只有认识公式、理解公式，准确应用公式表述问题，才能避免乱套公式、混淆公式的现象。

图1 断血流皂苷A的CSHPLC图谱

1.2.4 柱切换系统及操作 本实验应用自装定时装置，控制切换阀自动切换。该装置可预置T1(样品预处理时间)和T2(AC与PC串联时间)。样品进样的同时启动该装置，首先使切换阀处于PC与AC并联的A(预处理)状态，经T1(2 min)时间的预处理后切换阀自动切换至PC与AC串联的B状态，使保留在PC上的样品组分被AMP洗脱至AC上，经T2(2 min)时间后，即自动切回初始A状态;待下次进样时再次启动该装置重复操作。

金-白云石阶段：形成自然金-方铅矿-黄铜矿、辉银矿等矿物组合，为金的次要成矿阶段，方铅矿、黄铜矿、辉银矿主要在这个阶段富集。

2.4 重复性试验 取断血流皂苷A对照品大鼠血浆液，按1.2.3项下样品处理步骤处理制备6份对照品溶液，采用断血流皂苷A血浆柱切换高效液相色谱法测定，得RSD为2.1%(n=6)，表明本方法重复性良好。

马克思主义哲学关于内容和形式相互作用的描述中，认为内容是决定形式的，内容必须要有与之相适应的形式，同时，形式也是反作用于内容的，是能够促进或者阻碍内容发展的。因此，在思想文化融入基层生产的过程中，载体的作用是万万不可小看的，它为枯燥、抽象的思想文化工作注入了生命的活力，找到了思想文化在生产经营工作中的切入点。

4月21日，袁世凯发布临时大总统令：“现在国务院业经成立，在京原有各部事务，应即分别交替。由各部总长接收办理。”在临时大总统的命令下，前清部院立即停止办公，准备办理交接手续。

1.2.3 样品处理步骤 取大鼠血浆样品1.0 mL，置2 mL具塞离心试管中，加0.3 mol/L的三氯乙酸0.2 mL，离心(4 000 r/min，10 min)，精密量取上清液置于试管中，氮气吹干，残渣用15%甲醇溶液转入1 mL量瓶中，加15%甲醇至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

2.6 净化回收率 取一定量(高、中、低3种浓度)断血流皂苷A对照品血浆液，按前述色谱条件测定含量5次，另取相同进样量断血流皂苷A对照品溶液，直接进样测定。按峰面积计算，得血浆净化回收率，结果见表1。

表1 净化回收率结果(n=5)

2.7 方法回收率 于空白大鼠血浆中加入一定量(高、中、低3种浓度)断血流皂苷A对照溶液，按1.2.3项下样品处理步骤处理，按前述色谱条件测定含量5次，求出回收量浓度(即实测值)与加入量浓度之比，即为断血流皂苷A血浆空白加样回收率，结果见表2。

表2 方法回收率结果(n=5)

3 讨论

3.1 预处理柱选择与作用

实验初期曾用保护预柱(8 mm×4.0 mm)作预处理柱，虽基本能达到预期效果，但峰形很快变宽，影响测定的稳定性，然后采用20 mm短分析柱作预处理柱，保留时间恒定，峰形好，寿命长。

3.2 切换时间选择

切换时间窗越窄，则进入分析柱的杂质越少，但由于预处理柱未置恒温箱内，室温变化，流动相放置或新配后对保留时间均有一定影响，选择时间窗较宽一些，虽然前面杂质峰多一点，但不影响测定。

综上所述，本法具有操作简便，灵敏准确的特点，适用于断血流皂苷A血药浓度测定、药代动力学以及生物利用度的研究。

［1］彭代银，刘青云，戴 敏，等.荫风轮总苷的一般药理学试验研究［J］.安徽医药，2005，9(7):486-488.

［2］张文珠，张 虹，蒋生祥，等.HPLC柱切换技术在临床药物分析中的应用［J］.分析测试技术与仪器，2002，8(1):5-9.

［3］赵新锋，祝忠民，刘爱芳，等.柱切换法在复方丹参滴丸中丹参素药代动力学研究中的应用［J］.中成药，2004，26(6):490-492.

［4］向 瑾，余 勤，梁茂植，等.柱切换高效液相色谱法测定人血浆中布洛芬对映体浓度［J］.分析化学，2008，36(3):311-315.