HPLC法测定黄连药材及其炮制品中主要生物碱的含量

阳 勇， 李铁刚， 朱晶晶， 钟国跃， 王 欣， 王智民， 武小赟， 罗维早*

(1.重庆市中药研究院，重庆400065;2.中国中医科学院中药研究所，北京100700)

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连 Coptis teeta Wall.的加工品［1］，常用的炮制品有黄连饮片、酒黄连、姜黄连、萸黄连。2005年版《中国药典》一部黄连含量测定项下仅以小檗碱作为对照，采用薄层色谱扫描法测定，且仅规定了黄连药材中小檗碱的标准。小檗碱虽是黄连的活性成分之一，但在黄柏、三棵针、十大功劳、唐松草等植物中都存在，且目前已有作为医药原料药的小檗碱生产上市，显然以此作为黄连唯一的指标成分客观性和专属性较差;薄层色谱扫描法影响因素多，操作较复杂，已逐渐被HPLC替代进行含量测定;黄连炮制品系黄连用药的主体，故不仅要求对黄连药材进行质量控制，更需要制定其炮制品的质量标准。本实验在参考文献［2-4］的基础上，采用液相色谱法，对不同来源、批次的黄连药材及其炮制品进行了含量测定，并制定了相应标准。

1 仪器与试药

岛津LC－2010型液相色谱仪(含自动进样器，Class VP6.1－sp1色谱系统);三用紫外线分析仪(上海顾村电光仪器厂);KQ250DB型数控超声波清洗器(巩义市予华仪器有限责任公司);AUW220D型电子天平(十万分之一，日本岛津公司);BS224S型电子天平(万分之一，德国赛多利斯公司);

盐酸巴马汀对照品(批号:110732—200506)，盐酸小檗碱对照品(批号:110713—200208)，盐酸药根碱对照品(批号:0733—200005)，以上3个均由中国药品生物制品检定所提供;盐酸表小檗碱对照品、盐酸黄连碱对照品由本院药化室提供，纯度98%以上;乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。黄连药材及其炮制品来源于2010年版《中国药典》项目，均经重庆市中药研究院生药室钟国跃研究员鉴定确认。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相为乙腈－50 mmol/L磷酸二氢钾溶液(50:50)(混合液中加15 mmol/L十二烷基硫酸钠，再以磷酸调节pH为4.0);流速:0.6 mL/min;检测波长:345 nm;柱温:30℃;进样量:10 μL。理论板数按盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰计算应均不低于5 000。

2.2 对照品溶液的制备 取盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品各适量，精密称定，用甲醇制成每 1 mL 含有9、17、12、60 μg 的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取药材粉末(过二号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－盐酸(100∶1)的混合液50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液2 mL至10 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 样品测定 取黄连药材及其炮制品样品，照2.3项下制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，色谱图见图1～2，结果见表1～5(带*的数据为Q检验和G检验的不合格数据)。

图1 混合对照品HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of reference standards

图2 样品HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of sample

运用统计方法中的Q检验法和G检验法对极值及相关数据进行检验，淘汰不合格数据，将剩余值求平均值。黄连药材的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.93%、1.85%、1.45%、6.01%;黄连饮片的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.73%、1.50%、1.13%、5.02%;酒黄连饮片的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.60%、1.18%、0.97%、4.26%;姜黄连饮片的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.65%、1.32%、0.99%、4.46%;萸黄连饮片的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.67%、1.32%、1.06%、4.60%。再综合分析，规定限度:确定黄连药材含盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱分别不得少于0.93%、1.80%、1.45%和6.00%;黄连饮片、酒黄连、姜黄连和萸黄连中盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量分别不得低于0.70%、1.50%、1.10%和5.00%。在此限量下，合格率均为80%左右。

表1 黄连药材的含量测定结果(n=3)

表2 黄连饮片的含量测定结果(n=4)

3 讨论

3.1 黄连及其炮制品中生物碱类化学成分复杂，在研究过程中，我们考察了流动相的pH、流速的变化、柱温的变化及样品不同制备方法、溶剂用量、不同提取时间;根据上述试验结果，确定了本研究中样品处理条件及色谱条件。本法简便易行、准确灵敏，重复性好，使用范围广，可用于检验、评价黄连、黄连炮制品及其相关产品。

3.2 现市场“黄连”药材中，绝大多数为“味连”;“雅连”与“云连”栽培规模极小，产量极低，主要以野生为主。本实验收集的市场黄连及其炮制品经原植物鉴定主要为“味连”，而“雅连”(四川洪雅)和“云连”(云南贡山)药材仅在原栽培地区分别采集了各一批。含量测定结果表明雅连和云连中生物碱成分的含量与味连相比存在较大差异，特别是其中的盐酸小檗碱及盐酸巴马汀含量相当低，故在确定限度时未将二者计算在内，文章中列出，供参考对照。

表3 酒黄连饮片的含量测定结果(n=4)

表4 姜黄连饮片的含量测定结果(n=4)

3.3 根据本实验对黄连药材及其各种炮制品的含量测定结果可知，黄连药材及黄连饮片、酒黄连、姜黄连、萸黄连中4种生物碱的含量高低顺序均为:盐酸小檗碱>盐酸黄连碱>盐酸巴马汀>盐酸表小檗碱;同一来源的炮制品中，盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的平均含量高低次序均为:萸黄连>姜黄连>酒黄连。相对黄连药材而言，炮制品中各生物碱的含量均有所减少而以酒制样品减少最多，这可能是部分生物碱在炮制过程中损失掉，而黄酒利于黄连中生物碱的溢出，因此减失较多而含量降低。

表5 萸黄连饮片的含量测定结果(n=4)

3.4 根据结果发现同一来源的不同炮制品中巴马汀、小檗碱、表小檗碱、黄连碱4种生物碱具有相近的含量，以至于不分炮制品种类，只要是同一来源的黄连、黄连饮片、酒黄连、姜黄连及萸黄连可能均为含量合格或含量不合格的样品。对此有待进一步深入的研究。

3.5 由上表中数据发现，各样品中盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量存在一定的比例关系，不合格的样品也是如此，对此将作进一步的讨论研究。

3.6 本次研究结果表明，除盐酸小檗碱外，其他几种生物碱的含量也较高，显然，2005版《中国药典》仅以小檗碱作为对照，客观性、准确性和专属性均不强，将其他3种主要生物碱列为含量限度指标有利于药材及炮制品的质量控制，提高了药材及炮制品的质量标准。

［1］中国药典［S］.一部.2005:213.

［2］樊冬丽，廖庆文，鄢 丹，等.黄连不同炮制品中生物碱类成分的比较研究［J］.解放军药学学报，2006，22(4):276-279.

［3］王克英，方玲芬.酒黄连中小檗碱HPLC含量测定［J］.中国中药杂志，2007，32(22):2443-2444.

［4］张红梅，程雪梅，王长虹，等.黄连中生物碱提取工艺的正交试验研究［J］.中国医药工业杂志，2008，39(8):588-590.

［5］刘 芳.黄连品质评价的研究及其应用［D］.四川:四川大学，2005.