不同工艺纯化参芪扶正方中有效成分研究

袁旭江， 袁梦泓， 张来华， 朱盛山

(广东药学院，广东广州510006)

参芪扶正注射液是由党参和黄芪组成的中药复方制剂，具有益气扶正作用，临床用于气虚证肺癌、胃癌的辅助治疗，与化疗合用有助于提高疗效、保护血象，提高气虚患者免疫功能、改善气虚症状及生存质量［1-3］。该方主要有效成分有黄酮类、皂苷类、多糖等［4］，其中多糖含量最高。目前对党参、黄芪提取纯化研究多集中在皂苷类和多糖类成分方面［5，6］，而黄酮类等具发色团的其他成分研究评价方面报道较为鲜见，在HPLC/UV/ELSD指纹图谱联合评价方面也鲜见。中药及其复方提取纯化技术和评价方法是中药制剂现代化的关键技术，一直受到关注和重视，因此，笔者以参芪扶正方为研究对象，采用大孔树脂法、水提醇沉法、聚酰胺法等［7-9］多种纯化工艺对参芪水煎液中除多糖外的其他成分进行纯化研究，运用高效液相紫外吸收色谱联合蒸发光散射图谱进行指纹图谱技术分析，结合黄芪甲苷和芒柄花素等指标，考察不同纯化工艺对参芪扶正方中有效成分的影响，探讨更为有效的中药纯化技术及其评价方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100液相色谱仪系列(美国，二极管阵列检测器)，蒸发光散射检测器(美国Alltech 3300)，H.S.G-IIB-4电热恒温水浴锅(上海仪表(集团)供销公司)，BS124S电子天平(Sartorius)，BP211D电子分析天平(Sartorius，十万分之一)，DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 试药 黄芪药材(批号080707)、党参药材(批号080908)均由丽珠集团利民制药厂提供;黄芪甲苷对照品(批号110781-200613)和芒柄花素(批号111703-200501)由中国药品生物制品检定所提供;D101型大孔吸附树脂(上海树脂厂);聚酰胺(批号20090617，浙江台州路桥四甲生化塑料厂);乙腈为色谱纯，水为三蒸水;甲醇、乙醇、磷酸等试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 参芪水煎液制备 党参、黄芪药材各400 g，加水煎煮3次，第1次加水10倍煎煮1 h，第2次加水8倍煎煮1 h，第3次加水6倍煎煮0.5 h，过滤，合并滤液，浓缩制成含生药1.0 g/mL的药液，备用。

2.2 水提醇沉法

2.2.1 一次醇沉法:吸取参芪水煎液3份，每份20 mL，分别加入乙醇使含醇量达50%、60%和70%，边加边搅拌，静置24 h以上，过滤，滤液回收乙醇后用水定容50 mL(相当于生药0.4 g/mL，下同)，备用。

2.2.2 二次醇沉法:吸取参芪水煎液20 mL，加入乙醇使含醇量达60%，边加边搅拌，静置24 h以上，过滤，滤液浓缩回收乙醇至含生药2 g/mL，再加入乙醇使含醇量达80%，充分搅拌后静置24 h以上，过滤，滤液回收乙醇后用水定容50 mL，备用。

2.3 聚酰胺法 分别称取处理好的聚酰胺(100～200目)3份，每份2.5 g，湿法装柱(柱长20 cm，直径1.1 cm)，分别精密吸取参芪水煎液2 mL上柱，用水洗脱至流出液无色，弃去，分别用50 mL不同浓度乙醇(30%、50%、70%)洗脱，收集洗脱液，浓缩，用水定容5 mL，备用。

2.4 D101大孔树脂法 分别称取D101大孔树脂3份，每份2.5 g，乙醇浸泡24 h后装柱(柱长20 cm，直径1.1 cm)，用乙醇反复洗脱，洗至洗脱液与水(1:2)混合不产生混浊，再用水反复洗至流出液无乙醇味，分别精密吸取参芪水煎液2 mL上柱，预吸附0.5 h，用水洗脱至流出液无色，弃去，分别用50 mL不同浓度乙醇(30%、50%、70%)洗脱，收集洗脱液，浓缩，用水定容5 mL，备用。

2.5 含量测定及指纹图谱分析方法

2.5.1 色谱条件:Agilent ZORBAX SB-C18柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流动相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，0～2 min，5.0% ～5.0%(A)，2 ～30 min，5.0% ～60%(A)，30 ～32 min，60% ～60%(A);流速:1.0 mL/min;运行时间32 min;紫外吸收波长254 nm;蒸发光散射检测条件:温度40℃，气体流速1.5 mL/min，增益为1。该色谱条件同时用于含量测定和指纹分析。

2.5.2 芒柄花素对照品溶液及其标准曲线的制备:取芒柄花素对照品，精密称定，加甲醇制成每1 mL含26 μg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、2、5、8、10 μL 注入高效液相色谱仪，测定，以进样量(X，μg)对峰面积(Y，A)进行线性回归，建立标准曲线。结果显示，芒柄花素进样量在0.026～0.260 μg范围呈良好的线性，回归方程为 y=5 152.3x－101.39，相关系数 r=0.999 9。

2.5.3 黄芪甲苷对照溶液及其标准曲线的制备:取经105℃干燥2 h的黄芪甲苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1 mL含57 μg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液 1、2、5、8、10 mL 加甲醇定容至10 mL，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，以浓度的自然对数值为横坐标，峰面积的自然对数值为纵坐标进行线性回归，建立标准曲线。结果显示，黄芪甲苷进样量在0.057～0.570 μg范围呈良好的线性，回归方程为 y=0.946 4x+5.736 4，相关系数 r=0.999 9。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 精密度实验:分别精密吸取芒柄花素和黄芪甲苷对照品溶液10 μL进样，重复5次，测得芒柄花素的峰面积RSD为0.68%(n=5)，黄芪甲苷的峰面积RSD为0.85%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.5.4.2 稳定性实验:精密吸取2.3项下70%乙醇洗脱制得的供试品溶液 20 μL，分别在 0、2、6、12、24 h间隔进样，测得芒柄花素和黄芪甲苷的峰面积RSD分别为0.98%和1.12%(n=5)，表明样品溶液在24 h内性质稳定。

2.5.4.3 重复性实验:按2.3项下70%乙醇洗脱方法制备供试品溶液，精密吸取20 μL进样分析，测得芒柄花素和黄芪甲苷峰面积的RSD分别为1.25%和1.36%(n=6)，表明方法重现性好。

2.5.4.4 加样回收率实验:取2.3项下70%乙醇洗脱方法制得的已知含量的纯化液各6份，按1∶1比例分别加入芒柄花素和黄芪甲苷混合对照品溶液，按2.5.5项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定其含量，计算加样回收率。芒柄花素和黄芪甲苷的加样回收率结果分别为98.56%，RSD=1.52%(n=6)和 97.32%，RSD=1.91%(n=6)。结果表明，本实验处理方法回收率良好。

2.5.5 供试品溶液的制备和测定:吸取上述制得的纯化液5 mL，分别置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液各20 μL，注进高效液相色谱仪进行测定，分析，计算。

3 结果

3.1 指纹图谱分析结果

通过对参芪不同纯化液进行高效液相紫外光谱和蒸发光散射检测图谱进行联合分析，结果表明，在紫外波长254 nm处指纹图谱中最多共分离出13个信息峰(见图1)，各峰分离度好，塔板数较高，13号峰为芒柄花素峰;蒸发光散射指纹图谱中最多共分离出17个信息峰(见图1)，各峰基本能够达到基线分离，10号峰为黄芪甲苷峰，蒸发光散射指纹图谱反映信息较多，但峰值高度不及紫外光谱吸收指纹图谱中各峰明显。

图1 高效液相色谱UV和ELSD分析指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint by UV and ELSD

3.2 水提醇沉纯化结果

由图2和图3可见，不同醇沉工艺中出峰数量基本相似，其中二次醇沉工艺纯化效果相对要优于其他一次醇沉工艺，主要表现在蒸发光散射指纹图谱中黑色箭头所指部分和保留时间2～10 min部分基线情况，醇沉浓度越低基线漂移和噪音越高，采用二次醇沉工艺能够较好去除杂质，基线较为平稳，但仍存在较大噪音。且醇沉工艺仍存在较多的多糖类成分(见图中白色箭头所指)。

3.3 聚酰胺纯化结果

由图2和图3可见，乙醇浓度越高，洗脱力越强，出峰信息越多，保留时间越长峰值越高。从出峰个数和峰高度看，70%醇洗工艺与50%醇洗工艺基本相似，30%醇洗工艺较差，可见50%乙醇已可将大多成分从聚酰胺柱中洗脱下来。30%乙醇、50%乙醇和70%醇均能将黄芪甲苷和芒柄花素成分洗脱下来。通过聚酰胺柱吸附成分后，各纯化液在蒸发光散射指纹图谱中白色箭头和黑色箭头所指部分基本消失，保留时间2～10 min部分基线情况也变得平整。可见聚酰胺对参芪水煎液具有更好的纯化作用，以50%以上乙醇才能达到优质洗脱效果。

3.4 D101大孔树脂纯化结果

由图2和图3可见，大孔树脂柱中不同乙醇浓度的洗脱情况基本类似于聚酰胺柱。从出峰个数和峰高度看，70%醇洗工艺>50%醇洗工艺>30%醇洗工艺;以芒柄花素评价，其峰高以70%醇洗工艺最高，30%醇洗工艺最低;以黄芪甲苷评价，70%乙醇能很好将黄芪甲苷为代表的皂苷类成分洗脱下来，50%乙醇只能洗脱部分下来，30%基本洗脱不下黄芪甲苷成分。通过大孔树脂柱吸附成分后，各纯化液在蒸发光散射指纹图谱中黑色箭头所指部分和保留时间2～10 min部分基线情况基本类似，而白色箭头所指部分基本去除，以70%乙醇洗脱效果最佳。

3.5 三类纯化工艺比较结果

通过对上述各种纯化工艺进行比较(见表1、图2和图3)，结果显示，水提醇沉法所得纯化液的干固物最多;D101大孔树脂法所得纯化液的干固物大幅降低，成分随洗脱乙醇浓度增大而增高，对黄芪甲苷等皂苷类成分的吸附力强于芒柄花素等黄酮类成分;聚酰胺法纯化效果最佳，所得纯化液干固物最低，溶液颜色最浅，有效成分含量高，对芒柄花素等黄酮类成分的吸附力强于黄芪甲苷等皂苷类成分。

表1 三类不同工艺纯化效果比较Tab.1 Purification effect comparison of three types of different technologies

图2 不同工艺纯化液高效液相紫外光谱指纹图谱Fig.2 HPLC-UV fingerprint of purification liquid by different technologies

图3 不同工艺纯化液高效液相蒸发光散射指纹图谱Fig.3 HPLC-ELSD fingerprint of purification liquid by different technologies

4 结论与讨论

综上所述，以聚酰胺法有效成分含量最高，溶液颜色最浅，干固物量明显低于另两种方法，对芒柄花素等黄酮类成分的吸附力强于黄芪甲苷等皂苷类成分;D101大孔树脂吸附法次之，对黄芪甲苷等皂苷类成分的吸附力反而强于芒柄花素等黄酮类成分;水提醇沉法所得纯化液的干固物量最高。由此可见，在参芪扶正方提取纯化研究方面，聚酰胺法既可降低出膏量，又可很好地保留皂苷类、黄酮类等有效成分，可作为该方工艺改进的良好纯化方法。参芪扶正方中还含有大部分多糖类成分，该类成分有待单独进一步研究，聚酰胺和大孔树脂对皂苷类和黄酮类成分的吸附力不同，可考虑联合应用研究，有待进一步探索。

UV指纹图谱研究结果表明，在紫外波长254 nm处指纹图谱中共分离出13个信息峰，UV指纹图谱图能够较好反映参芪不同工艺纯化液中具有紫外吸收成分的保留情况，但难以更为直接的反映纯化液中各成分的相对含量，对于无发光团的成分难以评价，特别是杂质。

ELSD指纹图谱研究结果表明，在蒸发光散射指纹图谱中共分离出17个信息峰，蒸发光散射指纹图谱反映信息更多，从峰面积和峰高便能更好的反映各种成分的量。在参芪扶正方的研究中可知，蒸发光散射指纹图谱能够较好反映参芪不同工艺纯化液中有无发光团成分的保留情况甚至杂质的去除状况，如图中白色箭头主要反映多糖类成分，黑色箭头和10分钟之前的基线噪音大小提示纯化液中杂质的去除情况。通过两种图谱比较，除了10′为黄芪甲苷外，在蒸发光散射指纹图谱中的 7′、8′、11′、12′、13′、14′、15′、16′、17′号峰在紫外吸收指纹图谱未见吸收峰，可能为皂苷类成分。

中药及其复方提取物纯化效果评价方法一直是业界关注和探讨的重点和难点，且评价层次和要求越来越高，以高效液相色谱指纹图谱法为最有效的评价手段之一，多以UV指纹图谱评价，在ELSD指纹图谱评价方面较鲜见，且UV检测器只针对具有发色团成分，虽然UV光谱图具有很好的信号特征，但其低波长在急变梯度条件下受基线漂移困扰。而ELSD响应不依赖于样品的光学特性，对所有进入的物质均可检测，其响应值只与物质的量有关，能更好反映提取液的纯净程度，特别是对一些杂质去除具有一定的响应信息。

本文研究结果可为中药及其复方制剂提取纯化评价方法提供基础和依据。虽然ELSD指纹图谱能更好的反映提取液的纯化情况和各个成分的量，但对含量较低且具有发色团的成分，其响应值不及紫外光谱明显。故笔者建议，在中药及其复方制剂提取纯化评价方面可采用ELSD指纹图谱联合UV指纹图谱进行评价，才能更好更多提供提取液纯化后的质量信息。

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