液相色谱法测定多元维生素片中4种水溶性维生素

盛灵慧 赵正宜 王 晶 黄 峥

(中国计量科学研究院,北京 100013)

维生素(vitamin)又名维他命，是维持人体生命活动必需的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质。维生素在体内的含量很少，但在人体生长、发育过程中却发挥着重要的作用。目前，同时分析多种水溶性维生素的方法多有报道，主要为非离子对等度、梯度洗脱液相色谱法等，但在实际样品分析中目前已有的方法不能完全满足分离要求，难以消除基体干扰，使目标维生素不能获得理想的分离度。

笔者采用高效液相色谱法对复合维生素的分析方法进行了优化，考察了前处理过程中提取液的pH值、提取液的体积、超声温度等条件对于测量结果的影响。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent1200型,配有DAD紫外检测器，美国安捷伦公司；

恒温水浴槽： DK-8D型，上海一恒科技有限公司；

超声波清洗机：CQ25-12D型，宁波新芝生物科技有限公司；

电子天平：ME235s，d=0.01 mg，德国赛多利斯公司；

维生素标准物质：维生素B1(BW 3600)、维生素B2(BW 3601)、维生素B5(BW 3602)、维生素B6(BW 3220)，自制；

维生素药片样品：惠氏维生素银片、复合维生素B片，购自金象大药房；

三氟乙酸：99.8%，HPLC级，美国Sigma公司；

己烷磺酸钠：98%，HPLC级，美国Fisher公司；

甲醇：HPLC级，美国Fisher公司；

实验用水为Millipore超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters Atantis T3柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流动相：乙腈(A)-15 mmol/L 己烷磺酸钠和50 μL/L三氟乙酸混合溶液(B)，流速为1 mL/min；检测波长：210 nm；梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。

表1 洗脱程序

1.3 样品前处理

准确称取150 mg复合维生素样品于50 mL离心管中，加入45 mL盐酸水溶液(pH 6.0)震荡摇匀，随后将离心管置于30℃水浴中超声提取30 min，静置，取上清液过滤，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 水浴温度

在维生素片剂的测定过程中，维生素B2的溶解度很小，通常为了增加维生素B2的测试准确度，需要在一定的水浴温度下进行超声。超声是一种能量的释放过程，在超声的同时会带来水温的增加，在实验中发现，随着水温的变化，维生素片剂中维生素B1的测定结果具有显著性的差异。维生素含量随温度的变化曲线如图1所示。

对图1进行分析发现，随着水温的升高维生素B2的含量有所增加，增加幅度为4.1%，在30℃以后变化趋于平稳；而随着温度的升高维生素B1的含量急剧下降。综合比较之后实验选定30℃作为超声的初始温度，在超声过程中，确保水浴温度在30～40℃之间变化，为了增加维生素B2的溶出，实验中提高了水的体积，通过多次实验并参考了Pei Chen等发表的论文[1，2]确定样品与水的配比为150 mg/(45 mL)。

图1 维生素含量-温度曲线图

2.2 线性方程和检出限

采用百万分之一天平精密称取维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6，分别加水溶解配制浓度为0.573、0.400、0.834、0.734 mg/g标准储备溶液，之后依次稀释获得标准溶液，在选定的条件下进行液相色谱测试，以色谱峰面积(Y)对样品浓度(X)进行线性回归，4种维生素的回归方程、线性相关系数、线性范围和检出限(S/N>10)如表2所示。

表2 线性方程、线性范围和检出限

2.3 回收试验

准确称取维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B4、复合维生素各0.87、0.50、3.07、1.08、150 mg于50 mL离心管中，加水溶解后，定容至45 mL，30℃水浴超声30 min，取上清液过滤，按1.2色谱条件进行测试。测定结果及平均回收率如表3所示。

表3 回收试验结果(n=6)

2.4 日间稳定性试验

维生素样品的稳定性受环境条件影响较为明显，为了保证测试结果的准确性，进行了方法的稳定性试验。因为整个分析过程从样品的前处理到液相色谱测试完成不超过24 h，所以只进行了日间稳定性考察。稳定性测试结果列于表4。

表4 日间稳定性试验 mg/g

从表4测定结果可以得出复合维生素在日间的稳定性良好，4种维生素含量在24 h之内没有发生显著性的变化。

2.5 样品测试

根据实验中确定的前处理条件和液相色谱条件，对购买的两种复合维生素片剂中4种维生素的含量进行了测试，测试结果见表4。图2为4种维生素标准物质混合溶液色谱图，图3为惠氏维生素样品色谱图。

表5 样品测试结果 mg/g

图2 4种维生素标准物质混合溶液色谱图

图3 惠氏维生素样品色谱图

4种维生素均为水溶性维生素，极性较大，在普通的C18柱上保留较弱，通过加入离子对试剂改变了其保留特性，延长了保留时间。从谱图3中可以看到4种目标维生素能够在所选择的液相色谱条件下得到基线分离，消除了维生素片剂中其它组分的干扰，满足定量要求。

3 结语

所建立的液相色谱法具有较强的实用性，有效地避免了基体干扰等问题，测定过程简单，方法准确、可靠，重现性好，可用于实际样品中维生素含量的检测。

[1] Pei Chen， Wayne R Wolf. LC/UV/MS-MRM for the simultaneous determination of water-soluble vitamins in multi-vitamin dietary supplements[J]. Anal Bioanal Chem ,2007, 387: 2 441-2 448.

[2] Pei Chen, Mustafa Ozcan, Wayne R Wolf. Contents of selected B vitamins in NIST SRM 3280 multivitamin/multielement tablets by liquid chromatography isotope dilution mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem,2007,389:343-347.