快速自动化合成18F-FMISO及其质量控制

李 琳，黄飞杰，李敏聪，孙 华

昆明医学院第三附属医院，云南省肿瘤医院PET/CT中心，云南 昆明 650118

1-H-1-(3-18F-2-羟基丙基)-2-18F-硝基咪唑(18F-labelled fluoromisonidazole,18F-FMISO)是一种常用的硝基咪唑类乏氧显影剂，主要应用于乏氧组织的显像。它通过主动扩散进入细胞，硝基在硝基还原酶作用下被还原。在正常细胞内，硝基还原产物可立即被氧化；而在缺氧细胞内，硝基还原产物则不能发生再氧化，还原产物与细胞内大分子物质发生不可逆结合，滞留于缺氧细胞中，其浓集程度与乏氧程度成正比。因此，18F-FMISO可以用来表示肿瘤组织中细胞的缺氧程度[1]。目前18F-FMISO已用于测定鼻咽癌、头颈部恶性肿瘤乏氧状况及其放化疗效果，也有文献报道[2-3]可用于心脏缺血及灌注的研究。

18F-FMISO的化学合成方法主要有直接与间接标记法两大类[4-5]。前一类用两步法合成，即18F-首先与前体发生亲核反应，接着进行水解反应去掉保护前体的基团。后一类是在碱性条件下，18F-标记的反应中间体与硝基咪唑发生偶联反应。前一类方法反应过程简单、合成效率高，利于自动化合成；后一类方法由于常规化学物质中的溶剂二甲基亚砜(DMSO)不易处理、合成效率低，应用较少。

传统方法合成18F-药物多用氟多功能模块，但氟多功能模块价格昂贵、合成时间长，放射性损失较多，且操作复杂。Chang等[6]采用机器人系统合成18F-FMISO，降低了合成成本，简化了操作步骤，但机器人系统合成效率低，仅为30%。文献[4,7-8]报道有不同公司18F-FDG模块合成18F-FMISO，其中有GE、IBA和CTI公司等，并取得了较好的合成效率，但它们操作繁琐，合成成本较高。本工作拟在对传统FDG模块进行改良的基础上，采用两步法单管合成18F-FMISO,并对其进行较系统的质量控制。

1 材料和方法

1.1 试剂

H218O，丰度97%，美国Isotec公司；1-(2’-硝基-1’-咪唑基)-2-O-四氢吡喃基-3-O-甲苯磺酰基丙二醇(1-(2’-nitro-1’-imidazolyl)-2-O-tetrahydropyranyl-3-O-tosyl-propanediol，NITFP)及3-18F-2-羟基丙烷-2-硝基咪唑标准品，德国ABX公司；无水乙腈(色谱级)、Kryptofix222(K222)，美国Sigma公司；Sep-Pak Light QMA、Al2O3柱、C18柱，美国Waters公司；AG11A8柱、AG50柱，美国Bio-Rad公司；NaOH，分析纯，北京化学试剂公司；硅胶板，英国Whatman公司；广泛pH试纸，上海化学试剂公司；NaHCO3，分析纯，上海虹光化工厂。

1.2 动物

昆明种小鼠，体重为20～25 g，均为雄性，购自昆明医学院实验动物中心，动物生产许可证为SCKK(滇)2005-0008。室温：(20±2) ℃，自然光照，自由进食进水。

1.3 仪器

Sumitomo HM-10加速器，日本住友重机械工业株式会社；FDG-CPCU，北京派特生物技术有限公司；活度计和Radio-TLC放射性薄层扫描仪，美国Bioscan公司；分析型HPLC，配有UV201型紫外检测器、RI200型示差检测器、606泵、626泵、Sep-Pak C18柱，德国Alltech公司；BIOGRAPH 16 PET/CT扫描仪，德国Siemens公司。

1.4 实验方法

1.4.1系统组成 采用两步法单管合成，即亲核反应在反应管中进行，接着转移至水解柱上水解。整个合成过程通过计算机自动化控制FDG-CPCU完成。

1.4.218F-的生产 采用回旋加速器通过18O(p, n)18F核反应，应用小体积18O-H2O靶，用10 MeV、60 μA的质子束流连续轰击靶30 min。

1.4.318F-FMISO的自动化合成18F-FMISO的合成路线示于图1。自动化装置示于图2。1.5 mL K2CO3/K222乙腈溶液淋洗QMA将18F-淋入反应管，通入氮气加热除水，加入2 mL无水乙腈共沸除水。将5 mg的NITFP溶解于1.5 mL无水乙腈，通入氮气条件下加热105 ℃，反应300 s，之后除乙腈。加入2 mL 1 mol/L HC1，在110 ℃下加热水解180 s。加入1 mL 2 mol/L柠檬酸钠中和。混合物分别通过AG50柱、AG11A8柱、Al2O3柱、C18柱、无菌滤膜，进入收集瓶，收集产品。

图1 18F-FMISO的合成路线 Fig.1 Scheme of 18F-FMISO synthesis

图2 合成18F-FMISO的自动化装置示意图 Fig.2 Schematic diagram of 18F-FMISO automatic apparatus

1.4.4质量控制及检测方法 透过铅玻璃肉眼观察产品外观；pH试纸检测pH值；活度计测定产品活度；Radio-TLC及Radio-HPLC测产品的放化纯度。Radio-TLC：支持体为硅胶板，展开剂为95%的乙腈。Radio-HPLC：流动相为90%的乙醇，流速1 mL/min，紫外波长254 nm，碳水化合物分析柱。

1.4.5稳定性实验

(1) 体外稳定性实验

在室温下，不同时间1、2、3、4、5、6 h测定了18F-FMISO注射液的放化纯度。测定方法同1.4.4节。

(2) 血清温育实验

为了观察18F-FMISO在动物体内的稳定性，进行了血清温育实验。将18F-FMISO分别用生理盐水及新鲜人血清稀释10倍，在与体温同温度(37 ℃)的水浴中保温放置48 h，以便更好地模拟动物体内环境。在此期间选择12、24、36、48 h各取适量样品进行放化纯度测定，方法与上同。

1.4.6急性毒性实验 将24只正常昆明小鼠分成2组，其中一组按照每克体重5.55 MBq放射性活度尾静脉注射18F-FMISO，另一组尾静脉注射生理盐水，饲养，给药前后观察小鼠体重、进食、进水状况，密切观察异常毒性症状，特别是给药后的1、2日。以后每日观察1次，观察7 d。观察症状包括：① 行动，有无不安定、多动、发声；② 神经系统反应，有无举尾、振颤、痉挛，有无运动失调、姿态异常；③ 自主神经系统反应，有无眼球突出、流涎、下泻、竖毛、皮肤变色；④ 有无死亡。并记录体重、毒性反应和死亡情况，实验结束对存活动物进行解剖，如有病变进行组织学观察。

1.4.7无菌实验 取稀释后的18F-FMISO注射液分两管用营养肉汤培养基进行细菌培养。37 ℃培养18～24 h后，观察营养肉汤培养基是否完整光滑、有无浑浊及细菌生长情况，以此检查18F-FMISO是否无菌。

1.4.8正常小鼠体内药代动力学实验 将昆明种小鼠20只随机分成5组，每组4只，尾静脉注射经生理盐水稀释的18F-FMISO，每只小鼠220 GBq/L。分别于注射30、50、80、110 min后放血处死动物，摘取心、肝、肺、肾、脾、脑等脏器，用生理盐水清洗干净后分别称重，测定放射性计数率。另取小鼠5只，注射18F-FMISO后用活度计进行整体计数，并换算为计数率。取10%注射量的注射液(20 μL，活度约4.4 MBq)在活度计上进行测定。经时间衰减校正后，按(1)式计算不同时间小鼠每克组织18F-FMISO放射性摄取率[9]。用3P87程序对放射性浓度-时间曲线进行拟合，自动选择判定旁室模型并计算药动学参数。

每克小鼠组织放射性摄取率=

100%(%kg dose/g)

(1)

1.4.9肺癌模型小鼠体内分布实验及显像

(1) 肺癌小鼠模型的建立

将正常传代培养的YTMLC瘤株细胞，制成(2×105/mL)单细胞悬液，取0.1 mL皮下接种于小鼠右上肢腋下。造模6～7 d，使瘤体直径为0.5～0.8 cm。病理HE染色镜下癌组织呈腺样结构，腺腔内有乳头状突起。癌细胞呈圆形及梭形，细胞质丰富，核呈圆形，核仁明显、核分裂多见。

(2)18F-FMISO在肺癌模型小鼠的体内分布及显像

采用随机配对原则将模型小鼠按药代动力学方法进行实验分组，其余处理方法同1.4.8节所述，并计算每克小鼠组织放射性摄取率。

取给药后90 min的肺癌模型小鼠，处死后固定于PET/CT扫描床上，采用3D模式采集，重建后得到校正的18F-FMISO分布图。

1.4.10人体辐射吸收剂量的计算

(1) 人体组织放射性滞留率

将小鼠体内分布实验数据换算成70 kg标准成人的体内分布数据，按式(2)[6]计算人体组织放射性摄取率Ai(t)/A0。

(2)

式中，Ai(t)/A0，用药后t时刻人体组织i的放射性滞留率；Ai(t)，用药后t时刻人体组织i的计数率，min-1；A0，人体注射18F-FMISO的计数率，min-1。人的脏器和全身质量采用MIRD标准成人数据，小鼠质量采用本实验用鼠测定值的均值，进行整体测量的小鼠以注射后即刻测得的计数率(min-1)为注射剂量，按式(1)和(2)计算各时相的人体脏器和全身放射性滞留率Ai(t)/A0。

(2) 采用MIRD法计算人体内辐射剂量[10]

(3)

(3) 按式HE=ΣWtHt计算有效剂量，式中，HE为有效剂量(Sv)；Wt为t器官的组织权重因子(无量纲)；Ht为t靶器官的当量剂量(Sv)。已知，Ht=WRDt，WR为辐射权重因子(无量纲)。对18F-，WR=1.0，故Ht与Dt同值。本研究在计算有效剂量HE时，假定除本研究估算的靶器官吸收剂量外，其它靶器官吸收剂量取平均全身吸收剂量。

2 结果和讨论

2.1 18F-FMISO的自动化合成

本实验在对现有FDG专用合成模块(CPCU)计算机程序进行修改的基础上，采用适宜的密封方法阻断反应管与大气的连通，使得改良后的FDG模块在氟化反应时可以密封，提高了氟化反应温度，减少了合成过程中的放射性损失，从而有利于18F-FMISO的合成。改进的FDG模块为合成18F-药物创造了条件，充分发挥了FDG模块的潜力。在几十次的放化合成中均取得了较好效果。利用该全自动合成装置，不仅保证了较高的放化产率和化学纯度，而且避免了操作人员暴露于强辐射环境中。

实验采用了两步法，第一步为氟化反应，第二步为水解反应。而18F-FMISO的放射化学产率主要取决于第一步——氟化反应，这与前体NITFP的用量和标记温度有较大关系。实验所用的前体NITFP质量为5 mg。实验所需亲核反应温度为105 ℃[11]，这一温度高于乙腈的沸点(82 ℃)，因此，本工作采用改良的FDG模块，密封体系下自动化合成18F-FMISO。105 ℃下反应300 s，合成时间25 min，不校正合成效率为(50.3±1.6)%，校正合成效率为(61.8±2.3)%。

2.2 质量控制

透过铅玻璃肉眼观察产品为无色透明液体，pH=6.0～7.0，放射性浓度200～220 GBq/L，18F-FMISO平均活度2.1×103MBq，摩尔活度不小于4.0 TBq/mol。

放射化学纯度是衡量产品质量最重要的质量控制指标之一。本工作采用了TLC法及HPLC法对18F-FMISO的放射化学纯度进行了测定。TLC测量产品的放化纯度，游离18F-的Rf=0.1，18F-FMISO的Rf=0.6；HPLC测量放化纯度，游离18F-的tR=4.0 min，18F-FMISO的tR=5.3 min，与紫外所测标准品18F-FMISO的吸收峰一致；2种方法所测放射化学纯度均大于98%。

2.3 稳定性实验

2.3.1体外稳定性实验 在室温下，18F-FMISO注射液在1、2、3、4、5、6 h内的放化纯度分别为98.59%、98.57%、98.57%、98.56%、98.53%、98.53%，没有发生明显变化。

2.3.2血清温育实验18F-FMISO注射液37 ℃不同时间的放化纯度(RCP)列入表1。由表1可知，18F-FMISO在生理盐水和血清中保温48 h，标记的18F-仍与咪唑化合物牢固结合，几乎没有放射性损失。放化纯度保持在98.6 %以上。

表1 18F-FMISO注射液37 ℃不同时间的放化纯度(RCP)Table 1 Radiochemical purity of 18F-FMISO injection in different time at 37 ℃

2.4 急性毒性实验

尾静脉注射18F-FMISO后，观察各项指标：① 小鼠体重正常；② 行动如前，无不安定、多动、发声；③ 神经系统方面，无举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态异常等反应；④ 自主神经系统方面，未发现眼球突出、流涎、下泻、竖毛，皮肤颜色正常、呼吸正常；⑤ 观察1周后无小鼠死亡。计算小鼠存活率为100%。试验结束后将存活小鼠进行解剖，未发现重要器官病变。与注射生理盐水组相比，SPSS组间统计学分析无显著性差异。

2.5 无菌实验

取稀释后的18F-FMISO注射液分2管用营养肉汤培养基进行细菌培养, 37 ℃培养18～24 h后进行观察，营养肉汤培养基完整光滑，无浑浊，无细菌生长。

2.6 正常小鼠体内药代动力学实验

18F-FMISO在正常小鼠体内的生物分布结果列入表2。由表2可知，18F-FMISO在正常小鼠体内的放射性主要分布于肾脏、肝脏等腹腔脏器。由于18F-FMISO的脂溶性较高，脑内放射性较高，且从30 min到110 min清除较慢。肝、肾放射性较高，说明该药经消化系统代谢。

18F-FMISO的药代动力学参数列于表3。18F-FMISO的药代动力学符合三室模型[12]。静脉注射18F-FMISO后，药物从中央室进入浅外室，t1/2π仅为0.4 min；第二个时相是药物向深外室分布的α时相，伴随中央室血药浓度降低, 深外室药量逐渐增高，t1/2α=6.5 min；约经30 min后，血药浓度逐渐达到动态平衡，进入血液和组织药量平行下降的β时相，t1/2β=79.6 min。消除相半衰期远大于分布相半衰期。其主要原因可能是18F-FMISO在平衡前被总血池快速稀释和被组织迅速摄取、而代谢物却较长时间滞留于各组织中的缘故。

2.7 肺癌模型小鼠体内分布实验

注射后不同时相18F-FMISO在肺癌模型小鼠体内的生物分布结果列入表4。由表4可知，肺癌模型小鼠注射18F-FMISO后，全身各脏器除肿瘤外，在注药30 min均呈现高的放射性摄取，随着时间的推移放射性迅速降低。肿瘤组织摄取18F-FMISO在注药后80 min达到最大值，此后逐渐减低。不同时相点肿瘤对其它组织的每克组织放射性摄取率存在显著性差异(P<0.01)。各脏器不同时相18F-FMISO的放射性摄取之间也存在显著性差异(P<0.01)。这与正常小鼠体内放射性分布相一致。放射性主要分布在肾、肝等腹腔脏器，最高的为肾脏，而模型小鼠肿瘤组织也有较高的放射性摄取。结果表明，18F-FMISO在低氧组织中有较高的摄取。肿瘤细胞是一种低氧细胞，18F-FMISO能够浓集于其周围，定量在分子水平观察机体内肿瘤的乏氧情况，弥补了传统的18F-FDG PET检查的不足。通过18F-FMISO用于肿瘤乏氧显像和测定，使临床医生能够提高肿瘤诊断准确性，同时也提供了一种新的检测肿瘤疗效、判断肿瘤复发危险性的研究方法，并可能有助于对肿瘤的预后进行科学的评估。但结果也表明，18F-FMISO在肝、脾、肾内放射性较高，而18F-FMISO用于这些部位肿瘤的乏氧评价，会出现假阳性的结果，因此仍需开发新的乏氧显像剂对腹腔肿瘤进行乏氧评价。

表2 18F-FMISO在正常小鼠体内的生物分布Table 2 Biodistribution of 18F-FMISO in normal mice

注(Note)：n=6；a:P<0.01,与30 min比较(Compared with data at 30 min);b:P<0.01,与50 min比较(Compared with data at 50 min);c:P<0.01,与80 min比较(Compared with data at 80 min);d:P<0.01,与110 min比较(Compared with data at 110 min)

表3 18F-FMISO在正常小鼠体内的药代动力学参数Table 3 Pharmacokinetic parameters of 18F-FMISO in normal mice

注(Notes)：n=4；其中π、α、β为混杂参数；t1/2π、t1/2α、t1/2β分别为吸收项、分布项、消除项半衰期；K12、K21、K13、K31、K10分别为18F-FMISO由中央室进入浅外室、浅外室进入中央室、深外室进入中央室、中央室进入深外室以及中央室进入血液和组织的转运速率常数；Vc为表观分布容积；CL为总清除率；AUC为血药浓度-时间曲线下面积(n=4.π,α,βare compound parameters;t1/2π,t1/2α,t1/2βare half-life of absorption, distribution and elimination phases, respectively;K12,K21,K13,K31,K10are transport rate constants of18F-FMISO which from center to superficial-external compartment, from superficial-external to center compartment, from deep-external to center compartment, from center to deep-external compartment, and from center compartment to bloods and tissues, respectively;Vcis apparent volume of distribution;CLis clearance;AUCis area of drug concentration-time curve)

表4 注射后不同时相18F-FMISO在肺癌模型小鼠体内的生物分布Table 4 Biodistributions of different time-phase after injecting 18F-FMISO in bearing lung tumor mice

注(Notes)：n=7；a:P<0.01,与30 min比较(Compared with data at 30 min);b:P<0.01,与50 min比较(Compared with data at 50 min);c:P<0.01,与80 min比较(Compared with data at 80 min);d:P<0.01,与110 min比较(Compared with data at 110 min)

2.8 肺癌模型小鼠PET显像

荷瘤小鼠的18F-FMISO显像结果示于图3。由图3可知，肿瘤对示踪剂有明显的摄取，但同时小鼠腹部有大片放射性浓集，这是由腹部肝、肾及肠道内部较高的放射性浓集成一片所致，表明该示踪剂不适于腹部肿瘤乏氧的评价。

图3 18F-FMISO在荷肺癌鼠90 min时的PET显像Fig.3 Bearing lung tumor (arrows) mice of PET imaging at 90 min with 18F-FMISO

2.9 人体内照射吸收剂量的计算

2.9.118F-FMISO在人体各器官内的放射性滞留率-时间曲线 按式(1)和(2)将小鼠体内18F-FMISO的分布资料换算成70 kg标准人的体内分布数据，计算人各脏器的放射性滞留率(Ai(t)/A0)，绘制各脏器18F-FMISO在不同时相时的放射性滞留率-时间曲线，结果示于图4。由图4可知，在0～30 min内，肾的放射性滞留率最高，肝、肺、脾放射性滞留率也较高，心脏和脑的放射性滞留率较低。

图4 由小鼠实验结果推算18F-FMISO在人体内不同器官的放射性滞留率-时间曲线Fig.4 Typical fractional activity-time curves in different human organs measured from the distribution of 18F-FMISO in mice■——心(Heart)，●——肝(Liver)，▲——肺(Lung)，▼——脾(Spleen)，◆——肾(Kidney)，◀——脑(Brain)，▶——肿瘤(Tumor)

3 结 论

采用改良的FDG-CPCU，以NITFP为原料，经氟化、水解两步法全自动快速合成了18F-FMISO，并进行了较系统的质量控制。结果表明，各项指标均符合要求，但荷瘤小鼠的18F-FMISO显像结果提示，肿瘤对示踪剂有明显摄取的同时小鼠腹部也有大片放射性浓集，因此在行腹部肿瘤显影时，还应开发或结合其它特异性正电子药物联合诊断。

表5 1 MBq 18F-FMISO在人体各脏器的累积活度和体内照射吸收剂量Table 5 Cumulated activities and radiation dosimetry of 1 MBq 18F-FMISO to human subjects

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