中期因子在下咽癌组织中的表达及其临床意义*

刘 勋

(青岛大学医学院 266003)

下咽癌是耳鼻咽喉科恶性程度较高的恶性肿瘤，国内统计占全身恶性肿瘤的0.15%～0.24%，占头颈部恶性肿瘤的2%；国外统计数字显示其年发病率为0.8/10万，占头颈部肿瘤的5%，占全身肿瘤的0.3%。绝大多数(95%)的下咽癌为鳞状细胞癌，有较强的侵袭和转移能力，其淋巴结转移率高，就诊时约有50%～60%的患者颈部淋巴结肿大，在临床上下咽癌预后依靠许多因素判断，其中最为重要的是有无发生淋巴结转移，下咽癌的浸润和转移是制约进一步提高治愈率的重要原因。为了提高治愈率，帮助临床医生更加准确地判断预后，以便进行合理的个体化的综合治疗，因此有必要寻找下咽癌的分子生物学指标。中期因子(MK)是近年来发现的一个新的生长因子，在调控肿瘤血管生成过程中起重要作用，与血管生成密切相关[1]。本研究拟通过免疫组织化学二步法研究MK在下咽部肿瘤中的表达及其与肿瘤各临床病理因素之间的关系，探讨MK成为控制肿瘤生长及转移的一个新的理想靶点的可能性。

1 材料与方法

1.1临床资料 选择泰安市中心医院2004年10月～2009年7月手术切除后经病理检查诊断明确为下咽癌的存档蜡块。所有患者在术前均未行放疗、化疗、激素治疗或免疫治疗。其中男41例、女6例，年龄38～76岁，平均(56.75±9.90)岁。组织学类型：高分化17例、中分化12例、低分化18例，按UICC1997国际TNM分期标准：T1+T2期22例、T3+T4期25例，有淋巴结转移27例，无淋巴结转移20例。所有患者均无远处转移，对照组为下咽癌切缘组织15例。

1.2方法 采用免疫组化染色SP法,每例蜡块连续切4 μm切片2张。1张作苏木精-伊红染色供对照观察,另一张作MK抗体染色。鼠抗人MK多克隆抗体购自武汉博士德公司。染色方法按照SP-9000通用型试剂盒说明书进行。SP法免疫组织染色流程均设对照作为质量控制:以预实验阳性切片为阳性对照,用0. 01 mol/L pH值为7.4的PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3免疫组化结果判定 MK显微镜下观察:以细胞膜和(或)细胞质中出现清晰棕黄色颗粒作为阳性判断标准，否则为阴性。结果以阳性细胞数所占百分比表示，即光镜(100×)下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞数≤5%为弱阳性，5%～15%为中等阳性，≥15%为强阳性，如无表达为阴性。

1.4统计分析 采用SPSS13.0软件进行统计分析，计数资料的比较分析采用χ2之检验。

2 结 果

2.1MK在下咽癌与正常癌旁组织粘膜中的表达 47例下咽鳞状细胞癌中，MK表达阳性者为32例，阳性表达率为68.1%，正常癌旁组织中MK表达阳性为1例，阳性表达率为6.7%，两组差异具有统计学意义，见表1。癌组织中MK主要表达于癌细胞中的胞浆和胞膜，呈棕黄色，细胞核无染色，染色在癌组织内呈弥漫性分布，见图1。

表1 MK在下咽癌组织与癌旁组织中的表达

图1 MK在下咽癌细胞组织中的表达(SP×400)

2.2MK表达与下咽癌临床病理学参数的关系 MK在不同病理分化程度的下咽癌患者中的表达无显著性差异，临床T1﹢T2期的MK蛋白的表达阳性率为45.5%，T3﹢T4期的MK蛋白的表达阳性率为88%，两组差异存在显著性差异，27例有淋巴结转移的MK阳性表达率为(85.19%)，明显高于无淋巴结转移者(45%)，差异有显著性见表2。

表2 MK表达与下咽癌临床病理学参数的关系

3 讨 论

1988年，Muramatasu等运用差异杂交的方法从视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM1细胞cDNA文库中筛选出一种新的基因，该基因在小鼠妊娠中期广泛表达，出生后，只在肾脏有表达。因此，人们将这一新基因产物命名为Midkine，是妊娠中期(midgestation)和肾脏(kiney)的缩写。MK最初被描述为胎儿与新生儿发育过程中的调节因子，其表达谱在发育过程中高度上调，表达高峰出现在胚胎发生的中期，而成年后仅在肾脏中表达。其他正常组织几乎测不出mRNA表达，目前MK的4种生物学功能己被证实：(1)促进胚胎脑神经元的轴突向外生长；(2)增加主动脉内皮细胞的血浆酶原活性；(3)使NH3T3细胞癌性转化；(4)在纤维母细胞系中促进血管生长和有丝分裂作用。

有研究表明，MK在调控肿瘤血管生成过程中起重要作用，与血管生成密切相关。Muramaki等[2]实验发现转染MK基因的膀胱癌细胞在裸鼠体内成瘤能力强于对照组，组织病理学证实这种肿瘤生长速度加快与微血管密度增高有关。有实验发现，MK除在卵巢癌细胞表达外，在卵巢上皮性癌细胞的间质中血管内皮细胞也呈弱阳性染色，在血管密集处尤其增强，提示MK可能具有刺激内皮细胞增殖，促进肿瘤间质血管形成的作用[3]。MK高度表达于Wilms瘤、肾细胞癌、肺癌、神经纤维瘤和胃癌来源的细胞株。后来，一些实验室综合研究了MK基因在人类肿瘤中的表达，采用Northern印迹或RT-PCR研究了MK基因在Wilms瘤、神经纤维瘤、肝癌及来自肺、结肠、胰腺癌和肾的异种移植肿瘤中的表达谱。研究发现，在大多数标本中，MK转录水平明显高于正常对照组织。在大多数乳腺癌组织中也发现有MK表达，但在非肿瘤组织中未见表达。MK在神经系统肿瘤如脑胶质瘤中也有表达，且高表达患者预后通常较差。虽然MK阳性表达率报道不一，但几乎所有人类实体恶性肿瘤均有MK表达。而且免疫组化及原位杂交分析发现MK转录产物主要位于细胞质，而细胞核无阳性染色，且MK强阳性染色的癌细胞多位于浸润的前缘地带。罗祥基等[4]应用免疫组织化学染色、Western印迹等方法检测，在正常肝组织及良性肝病变组织中，MK无表达；而在人肝细胞癌组织中，MK高表达；在癌旁肝硬化组织中，MK微量表达。Ying-Jia Ren等[5]的研究也发现，MK在食管鳞状细胞癌中过度表达，且在肿瘤血管形成和侵袭中起重要作用。MK表达情况不一样，微血管密度值也不一样，且在肿瘤细胞浸润前缘MK蛋白的表达较其他部位更明显，微血管密度也高，血管生成活跃，表明MK蛋白与血管生成部位的一致性，这提示MK可能是肿瘤发生、发展过程中血管生成重要的诱导因素。因此，通过阻断MK的产生或拮抗其功能，可以达到抑制肿瘤血管生成，限制肿瘤生长和转移的目的。Mashour等[6]的实验结果表明MK在肿瘤血管内皮细胞表达，而在正常血管内皮细胞不表达。转染MK基因的膀胱癌细胞在裸鼠体内成瘤能力强于对照组，组织病理学证实这种肿瘤生长速度加快与微血管密度增高有关[7]。MK在肿瘤演进中的变化显示其在癌变早期发挥着生物学功能，有可能用于肿瘤预后的判断。

我们系统地观察了从下咽癌切缘组织到不同分期的下咽癌组织中MK的表达情况，发现其表达是不断增加的，提示其可能参加了下咽癌的恶性转化过程。有淋巴结转移的MK阳性率表达高于无淋巴结转移的，说明MK参与了下咽癌的浸润和转移。本组研究还发现MK的表达与肿瘤的分化程度无关，高分化和中低分化相比差异无显著性。研究同时还发现MK表达与肿瘤浸润深度有关，随着浸润深度的增加，表达逐渐增强，说明MK在下咽癌中可促进肿瘤的侵袭。已知肿瘤血管生成是启动肿瘤细胞转移的最早步骤之一，我们认为MK促进肿瘤的侵袭可能与MK能促进肿瘤的血管生成有关，因为我们在下咽癌细胞间质中发现血管内皮细胞和弹力膜有MK的表达，提示MK可能具有促进癌间质血管生成的作用，因而MK有可能是判断下咽癌预后的一个参考指标。在临床上我们还可以把MK作为下咽癌治疗的分子靶点，通过阻断或拮抗其功能达到抑制肿瘤血管生成的目的，为下咽癌提供一个新的治疗方向。

[1] 陆永良，姚行，戴利成，等.中期因子在胰腺癌组织中的表达及其临床意义[J].中华普外科杂志，2003, 18 (1) : 9-10.

[2] Muramaki M, Miyake H, Hara I, et al. Introduction of midkine gene into human bladder cancer cells enhances their malignant phenotype but increases their sensitivity to antiangiogenic therapy[J].Clin Cancer Res, 2003, 9(14):5152-5160.

[3] 原丹丹，李福琴，董春花，等.中期因子在卵巢上皮性肿瘤中的表达及临床意义[J].哈尔滨医科大学学报，2006, 40 (6) :464-466.

[4] 罗祥基，殷正丰，康晓燕，等.中期因子转录物及其蛋白在肝细胞癌中的定位与表达研究[J].中华普通外科杂志，2002,17:220-222.

[5] Ying-Jia Ren,Qing-Yun Zhang. Expression of midkine and its clinical significance in esophageal squamous cell carcinoma[J].World I Gastroenterol, 2006,12(13) : 2006-2010.

[6] Mashour GA, Ratner N, Khan GA, et al. The angiogenic factor midkine is aberrantly expressed in NF1-deficient Schwann cells and is a mitogen forneurofibroma-derived cells[J].Oncogene, 2001,20(1):97-105.

[7] Muramaki M, Miyake H, Hara I, et al. Introduction of midkine gene into human bladder cancer cells enhances their malignant phenotype but increases theirsensitivity to antiangiogenic therapy[J].Clin Cancer Res, 2003, 9(14):5152-60.