基质金属蛋白酶-9在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质的表达及干预研究*

马丽华 刘丽秋 朱 虹

(1. 青岛大学医学院研究生学院, 山东 青岛 266003； 2.泰山医学院附属泰山医院肾内科，山东 泰安 271000； 3.青岛大学附属医院肾内科，山东 青岛 266003)

近年来研究显示“肾间质纤维化是肾脏疾病进展到肾功能衰竭的共同通路”[1,2]，比肾小球病变更能预测预后。其发病机制十分复杂，目前尚不明确，但其过程涉及细胞、细胞外基质、细胞因子等及其之间的相互作用。据研究证实，基质金属蛋白酶及其组织抑制因子代谢紊乱可引起多种疾病，其中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是影响肾脏纤维化重要的一种[3]。本课题通过研究基质金属蛋白酶-9在单侧输尿管梗阻(UUO)模型大鼠肾间质的表达及赖诺普利与瑞舒伐他汀钙应用对其表达的影响，来探讨肾间质纤维化发生的可能机制并为临床进行肾间质纤维化防治提供理论依据。

1 方 法

选择健康雄性SD大鼠72只，均购自山东大学医学院试验动物中心，体重140～160克，随机分为4组，假手术组(A组)，模型组(B组)，赖诺普利治疗组(C组)、瑞舒伐他汀钙治疗组(D组)，每组各18只。所有大鼠按清洁级动物分笼喂养，饮用洁净水，饲养环境为每笼6只，温度(23士2) ℃，相对湿度为(55士2)%。将模型组和治疗组大鼠行左侧输尿管梗阻术，而假手术组大鼠只打开腹腔并游离左侧输尿管不予结扎。C组大鼠在手术前24h开始给予赖诺普利研细后溶于生理盐水中灌胃0.17mg/kg/d， D组将瑞舒伐他汀钙研细后溶于生理盐水中灌胃0.17mg/kg/d, A组及B组以等量的生理盐水灌胃。在术后第3, 7和14天分别处死各组中的6只大鼠，取出左侧肾脏，行 HE和MASSON染色，动态观察肾脏病理学改变，比较肾间质基质含量和纤维化程度;用免疫组织化学方法检测肾间质中基质金属蛋白酶-9的表达情况，并对以上实验结果通过图像分析系统进行半定量分析。

统计学处理,应用SPSS13.0统计分析软件处理数据。 计量数据用均数士标准差表示，组间比较采用方差分析。

2 结 果

在2周期间，模型组肾小管间质区域可见金属蛋白酶-9的表达均呈进行性升高，而治疗组则能明显降低基质金属蛋白酶-9的表达，且与模型组比较有明显差异(P﹤0.05)，但两治疗组间无明显差异(P>0.05)(见附表1)。左侧肾脏病理学改变:假手术组大鼠肾脏外观正常，大小如黄豆。梗阻大鼠的梗阻肾体积随梗阻时间的延长而逐渐增大，增大的肾脏内可见明显积水，积液清亮透明，肾实质随梗阻时间延长而逐渐变薄，肾孟扩张，肾盏乳头受压，弯(穹)隆部乳头变平钝，部分成凹形，乳头萎缩。模型组术后第3天，可见肾间质水肿，肾小管扩张，小管间质区域出现单核细胞、淋巴细胞浸润，术后第7天上述变化更加明显，发现扩张的肾小管有不同程度的萎缩和坏死，术后第14天可见肾间质区域炎细胞浸润有所缓解，而肾间质纤维化进行性加重;治疗组可明显减轻炎细胞浸润以及肾间质纤维化，且两治疗组间无明显差异;正常组则无上述变化(见图1)。

表1 各组大鼠不同时间点肾组织MMP-9蛋白IOD值的表达

注：⑴A组大鼠第3 7 14天各时间点肾组织MMP-9蛋白的IOD值相比均无显著差异(P>0.05)

⑵BCD组大鼠第3 7 14天各时间点肾组织MMP-9蛋白的IOD值相比有显著差异(P<0.05)

⑶*与A组比有显著差异(P<0.05)

⑷#与B组比有显著差异(P<0.05)

⑸C D组之间比较无显著差异(P>0.05)

A组

第3天

第7天

第14天

第3天

第7天

第14天

第7天

第14天

MMP-9组化

第7天

第14天

MMP-9组化

3 讨 论

肾脏组织纤维化是各种肾脏疾病进展至慢性肾衰的共同通路[1,2]，它与肾脏损害进展密切相关，决定肾功能预后，因此肾组织纤维化发病机制及其防治是当前研究热点之一。研究证实，肾脏组织纤维化包括肾小球硬化和肾间质纤维化。其中肾小球硬化病理表现为肾小球细胞的丧失、毛细血管腔的消失和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度积聚；肾间质纤维化病理表现为肾小管和间质毛细血管丧失及ECM过度积聚。因而目前认为，肾小球固有细胞合成和分泌ECM增加而其降解过程被抑制，导致ECM过度积聚和肾小球基质损伤后硬化，是引起肾组织纤维化的主要原因[4]。

据研究证实，基质金属蛋白酶及其组织抑制因子代谢紊乱可引起多种疾病[3]，慢性肾脏疾病是其中一种，其重要病理改变之一为细胞外基质在肾小球、肾小管积聚导致肾小球基底膜( glomerular basement membrane，GBM) 增厚、系膜区扩张及肾间质纤维化，而ECM的堆积是由于ECM 产生过多和降解减少所致。基质金属蛋白酶活性改变，与ECM堆积关系密切。Ⅳ型胶原同时是GBM和ECM的主要成分,而基质金属蛋白酶-9是降解IV型胶原的最主要酶之一，正常时对维持基底膜正常新陈代谢具有重要作用。研究证实基质金属蛋白酶及其组织抑制物是调控ECM降解最重要的酶系[5]，占细胞外基质降解酶总活性的70%以上。基质金属蛋白酶(MMPs)的活化被认为是ECM降解的限速环节[1]， 我们通过对UUO大鼠肾组织的免疫组化染色后发现，MMP-9的表达在UUO术后明显高于对照组，其表达量随着肾小管间质损害的加重而增加，在术后14d仍维持在较高的水平，国外的一些研究也得出了类似的结论[6，7]。导致UUO大鼠肾组织明胶酶系统合成增多的确切机制目前还不十分清楚，可能系由于梗阻引起肾小管间质ECM积聚，从而刺激MMP-9等代偿性增加以促进ECM的重塑过程。此外，明胶酶表达的升高还可能与梗阻肾局部组织浸润的中性粒细胞与巨噬细胞活化释放的生长因了介导[8]以及与细胞的表型由静息型向炎症型转化有关。

我们认为在病变的早期，肾组织MMP-9表达增强，虽然可能会使ECM的降解增强，但由于IV型胶原虽然是ECM的主要成分，但也同时是构成了肾小球基底膜(GBM)的基本网络框架结构的主要成分，其合成与降解的失衡或多肽链结构异常均影响GBM的分子构象和功能状态。MMP-9 表达异常可使IV型胶原合成和降解失衡，GBM重塑障碍,导致肾小球基底膜的损伤和ECM沉积的加重。MMP-9可能通过两种机制导致肾小球基底膜损伤：①诱导系膜细胞由静止表型转变为炎症表型，出现快速增殖，表达新型蛋白，合成ECM 增多，导致系膜基质堆积；②可降解基底膜，破坏细胞与基质的正常连接，致肾小球正常结构破坏，影响肾小球GBM的重塑。有研究证明：人基质金属蛋白酶抑制因—1(TIMP-1)表达逐渐增强则拮抗MMP-9的作用，导致ECM降解减弱，ECM堆积，肾组织出现纤维化，并进行性加重，最终导致肾脏硬化和肾衰竭。另有研究显示MMP-9使肾小管基底膜断裂，造成肾小管上皮细胞损伤以及GBM成分的改变和完整性的破坏，促进小管上皮细胞转分化，导致肾间质纤维化[9]。因此，MMP-9功能紊乱或调节异常可能参与了肾组织纤维化形成的病变过程。其确切机制有待进一步的研究证实。

血管紧张素II是RAS系统的主要效应成分，活性最大，它的血流和非血流动力学效应在慢性肾脏疾病的进展中起着重要作用。Ang II对肾小球出球小动脉的收缩超过入球动脉，使肾小球囊内压和滤过分数增加，肾小球毛细血管超滤系数降低，肾血浆流量减少，肾小球滤过率降低;AngII可使滤过膜上非选择性大孔的数目增加，平均孔径增大，导致尿蛋白滤出增加;AngII还可以直接介导肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞等增生以及诱导细胞合成分泌TGF, TNF, VEGF, ET, IL- 6等细胞因子;另外AngII促进纤溶酶原激活物抑制剂-1的产生，抑制纤溶酶原激活物的活性，阻断基质金属蛋白酶的活化，加之通过TGF- R 1增强蛋白酶抑制剂合成以降低蛋白酶在ECM降解方面的活性[10]，抑制ECM的降解[11,12]从而导致ECM在肾小球及小管间质区的大量沉积，引起硬化和纤维化。因此，从受体水平上阻断AngII的生物学作用，可降低血压及肾内压，缓解肾小球高灌注、高滤过，消除尿蛋白，改善肾小球和小管间质损伤及延缓慢性肾纤维化进展，从而发挥肾保护作用。他汀类药物：有临床研究报告他汀类药物在调脂的同时，可降低患者血浆炎症指标，包括MMP-9[13]。他汀类药物、胰岛素增敏剂或ACEI联合应用有协同作用，这与我们的研究结果一致。

在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质中基质金属蛋白酶-9的表达明显升高，且随着梗阻时间的延长，其表达数量也逐渐增加，出现肾间质纤维化。赖诺普利与瑞舒伐他汀钙均能有效抑制肾间质中基质金属蛋白酶-9的过度表达，从而改善肾间质纤维化，有潜在的延缓慢性肾功能衰竭进展的作用，且两者效果无明显差异。

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