槲皮素抗人脐静脉内皮细胞氧化损伤的作用研究*

李东娟 万云云

(1. 泰山医学院病理学教研室，山东 泰安 271000； 2. 泰安卫生学校，山东 泰安 271000)

在动脉粥样硬化(athrosclerosis,AS)发生的早期，最主要的变化是动脉内皮功能的紊乱，血管内皮细胞的损伤及功能改变是AS发生的初始环节[1]。氧化应激通过产生氧自由基介导血管内皮细胞损伤，与动脉粥样硬化发生等病理过程密切相关[2]。因此，寻找新的抗自由基和保护血管内皮细胞的药物对于防治动脉粥样硬化相关疾病有着重要意义。槲皮素及其衍生物是植物界分布最广的黄酮类化合物，也是人类饮食中最主要的生物类黄酮，其药理活性主要有抗氧化、抗炎、降血压、抗血小板聚集、抗癌变、抗衰老、抗突变、抗动脉粥样硬化等作用。研究证明，槲皮素的抗衰老、抗突变、抗动脉粥样硬化等生物活性都与抗氧化作用有关。随着人类对槲皮素作用的深入了解,其抗氧化活性已引起广泛关注[3]。本研究通过建立H2O2诱导HUVECs损伤模型，将Que作用于H2O2诱导的HUVECs，观察其对H2O2诱导HUVECs的影响，探讨Que对血管内皮细胞氧化损伤的保护作用，为其在心血管疾病防治中的作用提供理论依据。

1 材 料

1.1药物与试剂 槲皮素为Sigma产品，I型胶原酶、胰酶和DMEM+F12培养基购自美国GIBCO公司； MTT购自美国Sigma公司； PAA Gold A11-649胎牛血清购自PAA laboratories, Austria；D-Hank’s液实验室配制。缺口末端标记试剂盒(TUNEL)、MDA、SOD、LDH试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2主要仪器 SW-CJ-2FD超净工作台(苏州净化设备有限公司)；SANYO MCO-15AC CO2培养箱(SANYO Electric, Japan)；倒置相差显微镜(Olympus)；酶联免疫检测仪(英国Labsys- tems公司)。

2 方法

2.1人脐静脉内皮细胞培养 取出生1h内新生儿脐带用0.1%胶原酶灌注消化脐静脉内皮，以20%胎牛血清的DMEM+F12培养，融合生长至80%-90%即行传代。倒置显微镜下，细胞呈典型的铺路石状镶嵌排列。第Ⅷ因子相关抗原间接免疫荧光法鉴定呈阳性。第2-3代细胞用于实验。

2.2形态学观察 调整细胞密度为1×106/L接种于96及24孔培养板，培养24h后，换无血清培养液培养24h同步化后，随机分三组：阴性对照组(加等量D-Hank’S液)、模型组(200umol/L)、Que组(62.5、125、250 umol /L)，各组设8个复孔，于光镜下观察细胞形态。

2.3MTT法测定细胞存活率 在上述条件下培养24 h，然后用含5%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h，加入Que，继续培养24 h，将200umol/L H2O2加入模型组和Que组，刺激细胞6 h，每孔加入20ulMTT，37℃孵育4 h，倾去上清液，每孔加二甲基亚砜150ul，振荡数分钟，使紫色结晶甲臜充分溶解，在全自动酶标仪上于570 nm处测定吸光值(OD值)。

2.4Que对H2O2损伤血管内皮细胞MDA和LDH水平的影响 测定释放到培养基中MDA和LDH的量来判断细胞损伤状况。收集培养的内皮细胞并调节细胞密度为1×106/L，接种于24孔板,待细胞达70% ～80%后，分组同上。各实验组作用后收集培养上清液，按试剂盒说明书操作，比色法测定培养上清液和细胞裂解液中MDA和LDH的水平。

2.5超氧化物歧化酶活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法：黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈红色，分光光度计测其吸光度，计算被测样品中的SOD活性。

2.6TUNEL检测细胞凋亡 按TUNEL试剂盒说明操作，计算阳性细胞凋亡率(%)。

3 结 果

3.1细胞形态观察：倒置显微镜下动态观察可见阴性对照组细胞紧密贴壁，呈铺路石状生长。模型组可见多数细胞呈圆形，胞膜空泡，核浓缩；Que组见上述细胞较模型组明显减少。

3.2Que对H2O2损伤内皮细胞活性的影响 H2O2可引起HUVECs活性降低，与对照组比较差异有显著性(P<0. 01)，而Que各浓度组可抑制H2O2损伤引起的活性降低(P<0. 01)，且有随浓度增加而细胞活性增强的趋势(表1)。

表1 Que对H2O2诱导HUVECs活性的影响

注：与对照组比较:*P<0.01 与模型组比较:▲P<0.01

3.3Que对H2O2损伤血管内皮细胞MDA、SOD和LDH水平的影响：H2O2损伤可引起细胞内MDA和LDH释放增加，而SOD活性明显降低；Que预作用于损伤的细胞后，与模型组比较，MDA和LDH释放随浓度增加减少，SOD活性有所升高(P<0. 05，表2)。

表2 Que对H2O2损伤HUVECs释放MDA、SOD和LDH的影响

注：与对照组比较:*P<0.01 与模型组比较:▲▲P<0.05，▲P<0.01

3.4Que对HUVECs凋亡的影响 与阴性对照组对比, H2O2明显诱导内皮细胞凋亡的发生(P<0.01)。不同浓度Que组能明显减少细胞凋亡的发生, 与模型组相比有显著性差异(P<0.05)，以250umol/L浓度作用最强(P<0.01)，但与阴性对照组相比均未能达到正常水平(P<0.05，表3,图1)。

表3 Que对H2O2诱导HUVECs凋亡的影响

注：与对照组比较:**P<0.05,*P<0.01 与模型组比较:▲▲P<0.05▲P<0.01

阴性对照组(×200)

模型组(×200)

ue62.5 umol /L组(×200)

Que125umol/L组(×200)

Que250umol/L组(×200)

4 讨 论

以AS为基础的心脑血管疾病是目前系统发病率和病死率最高的疾病。血管内皮细胞结构和功能损伤与AS的发生和发展有着密切关系，它是AS的始动因素[4]。H2O2是机体产生的活性氧，在过氧化条件下能分解成一系列复杂产物，如氧自由基。氧自由基可与生物膜中的主要成份多价不饱和脂肪酸作用，引发脂质过氧化反应，产生大量脂质过氧化物及醛类产物，进一步损害生物膜，膜通透性增加，导致组织损伤，最终形成动脉粥样硬化斑块[5]。也有研究证明氧自由基的急性和慢性超载存在于动脉粥样硬化的全过程，导致内皮细胞损伤和加快内皮细胞凋亡[6-7]。H2O2在一定浓度范围内促使内皮细胞损伤和内皮细胞凋亡，过高浓度则导致细胞结构不可逆的损伤而致细胞死亡[8]。

噻唑盐(MTT)能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，该物质被二甲基亚砜溶解后，在570 nm处有一最大吸收峰，以酶标仪可定量测定其含量。通过MTT实验可直接反映细胞的活力，进而间接地反映细胞的存活情况[9-10]。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。本实验通过MTT法证实，H2O2可明显降低HUVECs活性, 不同浓度乔松素能显著增强HUVECs的活性，说明Que具有抗H2O2诱导的内皮细胞的损伤的作用。

LDH是细胞损伤后的代谢产物，它的活力反映细胞损伤的程度。MDA不仅是细胞损伤的代谢产物，而且是导致细胞损伤的机制之一。本研究发现，H2O2可导致人脐静脉内皮细胞产生的LDH和MDA增多，这表明H2O2能引起人脐静脉内皮细胞的氧化损伤，同时也抑制了细胞的增殖代偿能力。Que的预作用可抑制H2O2的损伤作用，使LDH活力和MDA含量降低。机体正常下存在完整的抗氧化体系，如SOD过氧化物酶在细胞浆和线粒体内发挥重要的防御作用。H2O2导致的抗氧化酶活力下降，清除氧自由基的能力降低等会进一步加重细胞损伤。本研究表明Que可提高损伤内皮细胞中SOD的活力。由此可见，Que可以减轻H2O2引起的内皮细胞的损伤，对血管内皮细胞损伤时的保护具有重要意义。

在正常情况下，内皮细胞的增殖率和凋亡率都很低，内皮细胞凋亡与增殖之间的动态平衡维持内皮细胞数量的稳定和血管功能的正常}。多项研究证实内皮细胞损伤、功能异常是冠状动脉粥样硬化发生的早期事件，而内皮细胞的过度凋亡却是内皮细胞功能失调的始动环节[12]。并且在动脉粥样硬化斑块形成的过程中，存在血管内皮细胞凋亡现象，并反过来参与和加速动脉粥样硬化进程。本实验通过TUNEL法明显观察到，三种浓度的Que均能部分拮抗H2O2诱导内皮细胞凋亡，说明Que可抑制H2O2对HUVECs的损伤，减少内皮细胞的凋亡，发挥其保护血管内皮细胞的功能，其确切机制有待进一步实验证明。

[1] Chudek J, Wiecek A. Adipose tissue, inflammation and endothelial dysfunction[J].Pharmacol Rep. 2006,58 Suppl:81-8.

[2] WangY K, HuangZQ. Protective effectsof icariin on human umbilical vein endothelial cell injury induced byH2O2in vitro[J].PharmacolRes, 2005,52(2): 174-82.

[3] Ferraresi R,Troiano L,Roat E,et,al·Essential requirement of reduced glutathione (GSH) for the antioxidant effect of the flavonoid quercetin·Free Radic Res,2005,39(11):1249～1258.

[4] 徐雅琴,张钧华,唐朝枢.氧化低密度脂蛋白和血管内皮损伤[J].心血管病学进展,2000,21(1):26-29.

[5] LankinVZ, TikhazeAK, Kapel koVI, eta.l Mechanisms of oxidativemodification of low density lipoproteins under conditions of oxidative and carbonyl stress[J]. Biochemistry (Mosc), 2007, 72(10): 1081-1090.

[6] Madamanchi NR, Vendrov A, Runge MS. Oxidative stress and vascular disease[J]. Arterioscler Thromb Vasc Bio,l 2005, 25(1): 29-38.

[7] Papaharalambus CA,GriendlingKK.Basic mechanisms of oxidative stress and reactive oxygen species in cardiovascular injury[J]. Trends Cardiovasc Med, 2007, 17(2):48-54.

[8] CaiH. Hydrogen peroxide regulation of endothelial function: origins, mechanis-

ms, and consequences[J]. Cardiovasc Res, 2005, 68(1): 26-36.

[9] 盂 晶,唐仕波,林少芬,等.银杏内酯B对体外培养的大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志, 2006, 22(2):791-795.

[10] MosmannT.Rapid colorimetricassayforcellurgrowth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays [J]. ImmunolMethods,1983,65(1-2): 55-63.

[11] DimmelerS, ZeiherAM. Endothelial cell apoptosis in an-giogenesis and vessel- regression [J].CircRes,2000,87(6): 434-439.

[12] HaunstetterA, Izumo S. Apotosis: basic mechanism and implication for cardiovascular disease [J].CircRes,1998,82(11): 1 111-120.