重组人血管内皮抑制素对人脑胶质瘤细胞生长的抑制作用*

程园园 安永恒 陈祥明 李健哲 魏 林

(1.青岛大学医学院附属医院肿瘤科,山东青岛 266003; 2. 泰山医学院附属泰山医院肿瘤内科, 山东 泰安 271000)

脑胶质瘤来源于神经上皮，是颅内最常见的原发性肿瘤，约占颅内肿瘤的33.3%～58.9%,平均43.5%[1]。具有高发病率、高复发率、高死亡率和低治愈率的特点。在目前技术条件下, 脑胶质瘤特别是恶性度高的脑胶质瘤预后还很不理想。全身化疗虽可达到治疗水平,但在肿瘤边缘药物浓度显著降低或几乎测不出,血脑屏障的通透性在瘤周区域也显著下降;而且脑内有效药物浓度维持时间很短。因而,虽然大多数医院对复发性脑胶质瘤多采用了手术+放疗+化疗的综合治疗方法,但效果仍不理想。近年来，间质化疗(interstitial chemotherapy)的研究解决了上述问题。本研究主要观察重组人血管内皮抑制素 (recombinant human endostatin)对人脑胶质瘤细胞增殖的影响,为临床间质化疗药物的筛选提供理论依据：

1 材料和方法

1.1 主要试剂

人脑胶质瘤细胞(U251，购自南京凯基生物科技发展有限公司)，DMEM培养基、胎牛血清(Gibco,美国)，重组人血管内皮抑素 (麦得津,烟台)，Fluo-3 探针(Molecular Probes,美国)，二氧化碳细胞培养箱(MCO-15AC型,日本) 多聚赖氨酸(Amresco分装)。

1.2 细胞培养[2]

人脑胶质瘤细胞株(U251)采用含1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5% CO2及饱和湿度下培养，隔天换液，待细胞长至80%～90%密度时，用0.01% EDTA-0.125%胰蛋白酶消化，按1∶3传代。

1.3 MTT法测定细胞增殖抑制率[3]

取对数生长期的胶质瘤细胞，用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液悬浮并调整细胞浓度为5～10×104/ml，以每孔0.1ml分别接种于96孔培养板，置于37℃、5%CO2和95%的空气条件下培养24h后，将上清液吸出，换新鲜培养液，并分别加入终浓度为50、100、150ng/ml的重组人血管内皮抑制素，每孔0.1ml，每个培养板均设一对照组(加入等量的细胞和含10%胎牛血清的DMEM培养液)，继续培养26h，每孔加入0.5～1mg/mlMTT液100?l，作用4h后终止培养，小心吸去培养孔内的上清液，每孔加入150·l二甲基亚枫，振荡溶解10min，490nm波长下测吸光度。以空白孔调零，每个浓度点8孔，实验重复3次。

1.4 统计学处理

运用Sigma Stat2.0统计软件处理实验数据，结果用平均数±标准差来表示

2 结 果

重组人血管内皮抑素各实验组的吸光光度值均较对照组值小(见表)，比较有统计学意义(P﹤0.05)。

表1 重组人血管内皮抑制素对人脑胶质瘤细胞增值的影响

注：Note:aP﹤0.05, vs control group

3 讨 论

内抑制素(endostatin)：是另一个肿瘤源性血管生成抑制物。1999年由O`Reilly[4]和Folkman等从患内皮细胞瘤(EOMA)的小鼠血清中首先分离得到。其分子量为20kD， 序列分析显示它是大分子物质胶原蛋白Ⅹ、Ⅶ的羧基末端胶原片段，一级结构有184个氨基酸，其中酸性氨基酸16个，碱性氨基酸29个，疏水性氨基酸占48%，是新发现的类胶原蛋白，主要位于血管的外周基底膜。基因敲除方法去掉胶原蛋白Ⅹ、Ⅶ的双等位基因，小鼠胚胎发育仍正常，无血管形态异常。这说明胶原蛋白Ⅹ、Ⅶ本身并不参与血管生成的调节，作为完整的蛋白无抑制血管生成活性[5]。重组人endostatin 和鼠endostatin具有83.33%的同源性，分子量为18kD。胶原蛋白Ⅹ、Ⅻ则主要存在于血管周围[5]。内抑制素的生物学作用如下：①抑制内皮细胞的增殖：实验发现较小剂量的内抑制素可特异性地抑制内皮细胞增殖。这可能是内皮细胞中存在特异性的endostatin受体或endostatin与血管生成因子之间竞争受体所致；②抑制在体血管生成：内抑制素对在体血管的作用表现为抑制其生成，而对其它正常组织细胞的正常功能无作用；③抑制动物移植瘤：内抑制素对多种动物的移植瘤有抑制作用，其机制在于其特异性地抑制内皮细胞增殖，从而抑制新生血管的生成，使实体瘤无法获得足够的营养而处于休眠状态，其抗血管活性比血管抑制素强。用内抑制素处理牛肺动脉内皮细胞可致后者凋亡，且可明显减少抗蛋白bcl-2和bcl-xL，而对Bax蛋白的水平则无影响。这种作用在其他几种非内皮细胞中并未被观察到。这提示内抑制素可能选择性地引起内皮细胞凋亡[5]。此外，内皮细胞的抑制血管作用还与其结合硫酸肝素蛋白多糖、介入生长因子的信号传递过程有关。FGF和VEGF是血管生长的主要正向调控因子，通过与血管内皮细胞表面的受体结合而发挥作用。内抑制素的晶体结构分析显示其蛋白分子表面存在大量的碱性残基、与硫酸乙酰软骨素具有较强的亲和力。后者是FGF信号传递途径中必需分子，从而暗示内抑制素的抗血管作用可能是阻断FGF信号传导有关。体内应用重组人血管内皮抑制素能抑制肺原发癌和转移癌的生长。持久使用内抑制素能使原发肿瘤消退，并抑制肿瘤的复发。

体外实验表明，内皮抑制素能抑制血管内皮细胞的生长及其迁移，并促进其凋亡，而不能抑制平滑肌细胞、成纤维细胞以及各种肿瘤细胞，如Lewis肺癌细胞的生长。动物实验表明，系统用药或局部给药可抑制多种原发性或转移性实体瘤的生长，如Lewis肺癌、纤维肉瘤[6]、黑色素瘤[7]、胶质瘤、肾细胞癌 (renal cell careinoma,RCC)[8]，并能使肿瘤处于休眠状态(肿瘤停止生长，但细胞异形性未变)，而且没有出现耐药性[9]。其他实验如微囊化内皮抑制素修饰细胞局部种植等都显示出其有较好的抑制肿瘤生长的作用。

[1] 王忠诚主编. 神经外科学[M].武汉:湖北科学技术出版社,1998 :397-450.

[2] 谢方民,程园园,邵旭建.内抑制素和血小板因子-4对淋巴管内皮细胞生成的影响[J].解剖学报,2005,36(4):386-389.

[3] Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983,65(1-2):55-63.

[4] O,Reilly MS,Boehm T,Shing Y,et al.Endostatin:an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J].Cell,1997,88(2):277-282.

[5] Dhanabal M,Ramchandran R,Wateman M J,et al.Endostatin induces endothelial cell apotosis[J].J Biol Chem,1999,274(17):11721-11726.

[6] Nakashima Y,Yano M,Kobayashi Y, et al.Endostatin gene therapy on Murine lung metastases model utilizing cationic vector-mediated intravenous gene delivery[J].Gene Ther,2003,10(2):123-130.

[7] Szary J,Szala S.Intra-tumoral administration of naked plasmin DNA encoding mouse endostatin inhibits renal carcinoma growth[J].Int J Cancer,2001 Mar15;91(6):83

[8] Bochm T, Folkman J, Browder T, et al. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance[J]. Nature,1997,390(6658):404-407.