卡培他滨对人鼻咽癌细胞CNE-2放射增敏作用的实验研究

杨 曙， 黄晓波， 莫凯岚， 孙奋勇

鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤，有研究显示，卡培他滨联合放疗治疗鼻咽癌，在临床上有显著的放射增敏作用，并取得较好的疗效，但其放射增敏的机制尚未明了[1]。本实验将卡培他滨联合放疗应用于人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞，通过克隆形成实验、流式细胞仪分析等观察卡培他滨对CNE-2鼻咽癌细胞系的放射增敏作用及其可能机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药物及试剂 CNE-2细胞为人类鼻咽低分化鳞癌细胞，由上海肿瘤防治研究所提供。卡培他滨由美国罗氏公司提供。RPMI-1640、胎牛血清购于美国Gibco BRL公司；Sulphorhodamine (SRB)、Rnase购于Sigma公司；Annexin V凋亡检测试剂盒购于北京大学医学部人类基因中心；流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品。

1.2 细胞培养 CNE-2细胞培养于含15%小牛血清、pH值为7.2的RPMI-1640培养液中，同时加入100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，在37℃恒温、100%湿度、5%CO2培养箱中常规培养，取指数生长期细胞进行实验。

1.3 细胞照射 使用6MeV X线直线加速器照射，照射距离为100 cm，照射野为10 cm×10 cm，室温下单次照射。

1.4 细胞增殖和活力测定 将指数生长期的CNE-2细胞经0.25% 胰酶+0.02% EDTA钠消化后，调整为细胞5×104/mL 的细胞悬液，接种于96孔板上，每孔100 μL。待细胞完全贴壁，将卡培他滨设置为6个不同浓度给药组，分别为0.01、0.1、1、10 、100、1 000 μg/mL，对照组不加药，另设空白对照组，每组设6个复孔。置37℃ 5% CO2培养箱孵育培养24 h后，加MTT 5 mg/mL，4 h后弃掉上清，各孔加入DMSO(二甲亚砜)100 μL，均匀震荡15 min，酶联免疫检测仪于570 nm波长测定吸光度。重复3遍。肿瘤细胞抑制率(%)=(1-给药组吸光度/对照组吸光度)×100%，计算卡培他滨抑制细胞增殖20%的药物浓度(IC20)[2]。

1.5 克隆形成实验测定放射增敏性 选用24 h IC20这个细胞浓度作放射增敏实验。将CNE-2细胞随机分为5个组：单纯照射组，卡培他滨作用3 h+ 照射组，6 h+照射组，12 h+照射组，24 h+照射组。除单纯照射组外，其余各组细胞分别给予卡培他滨(24 h IC20值)预处理3 h、6 h、12 h、24 h。随后将5组细胞用胰酶消化后接种于6 cm培养皿，每组分别设置3个培养皿，37℃ 5% CO2培养箱内培养24 h，弃药后给予单次照射，剂量分别为0、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy，在37℃ 5% CO2培养箱内继续培养14 d。14 d后取出培养皿，弃培养液，PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，弃去固定液，姬姆萨染色30 min，对含50个细胞以上的克隆进行计数，计算机进行统计学处理，用单击多靶数学模型进行曲线拟合做图，求曲线参数D0、Dq值。最后求放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)，公式：SER=单纯照射组D0值/卡培他滨+照射组D0值[3]。

1.6 流式细胞分析 5组细胞均给予6MV X射线单次照射6Gy，孵育24 h后胰酶消化，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，D-hanks清洗2遍，80% 乙醇4℃ 固定过夜，离心弃去乙醇， D-hanks再洗2遍，用Rnase(终质量浓度0.02 mg/mL)、PI(终质量浓度为0.1 mg/mL)避光染色30 min，流式细胞仪分析细胞周期分布情况及凋亡率。

2 结果

2.1 卡培他滨的IC20值 MTT实验表明，6个不同浓度的卡培他滨作用细胞24 h后，卡培他滨IC20值为0.26 μg/mL，细胞抑制率和药物浓度成正相关关系。结果见表1。

表1 卡培他滨对CNE-2细胞的抑制率

2.2 卡培他滨对CNE-2细胞的放射增敏作用 将5组CNE-2细胞分别给予0、2、4、6、8 Gy射线照射后，单击多靶模型拟合分析参数。卡培他滨各组增敏比明显高于单纯照射组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表2。细胞生存曲线见图1。

表2 卡培他滨不同作用时间后的放射增敏比(SRE)

与3 h组比较：*P<0.05，**P<0.01

图1 卡培他滨各组照射的细胞生存曲线

2.3 卡培他滨对细胞周期的影响 正常状态下的CNE-2细胞大多数处于G1期，S期次之，G2/M期最少。单纯照射组主要阻滞在G2/M 期，分布率为(28.6±5.7)%；卡培他滨不同给药时间联合射线组的细胞周期均发生明显变化，S期阻滞随着卡培他滨作用时间的延长而增加，以作用24 h后效果最为明显，与其余各组比较，差异有显著性(P<0.01)，见表3。

各组CNE-2细胞凋亡率随作用时间的延长而增加，以卡培他滨作用24 h组最为明显，达到(45.9±6.1)%，与单纯照射组比差异有统计学意义(P<0.01)，与其他组之间差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

表3 卡培他滨对细胞周期的影响

与正常对照组比较：*P<0.05,**P<0.01；与单纯照射组相比：△P<0.05,△△P<0.01

图2 卡培他滨对细胞凋亡率的影响与单纯照射组相比：*P<0.05, ** P<0.01

3 讨论

早期鼻咽癌通过放射治疗可以取得良好的疗效，但Ⅲ、Ⅳ 期单独放射治疗的疗效较差，其5年存活率仅为30%～55%[4]，因此，探讨放化疗合理的联合应用以提高鼻咽癌治愈率为目前研究的重点之一。卡培他滨作为5-Fu的前体药物，在体内经过酶的作用，最终转化为5-Fu而发挥抗癌作用。5-Fu是众所周知的鼻咽癌化疗的首选放射增敏剂，但因为其在体内的半衰期较短，只有15～20 min，所以只有连续静脉注射5-Fu且必须建立长期的静脉通道以维持一定的血药浓度，才具有肿瘤的放射增敏作用[5-6]。但这样做将导致一系列副作用，给患者生活带来不便，因此绝大多数患者都愿意接受口服化疗。卡培他滨较5-Fu有明显的优势：(1)口服吸收好，无需静脉置管；(2)血药浓度维持时间长，每日两次口服与5-Fu连续24 h静脉注射的药代动力学相仿；(3)具有亲肿瘤性，在正常组织中浓度远远低于肿瘤组织，毒性反应低[7-8]。

本实验研究显示，卡培他滨较低浓度(24 h IC20)对人鼻咽癌CNE-2 细胞系的放射增敏作用具有时间依赖性，卡培他滨作用时间联合放射治疗的协同效果在24 h后达到最佳，其放射时间增敏比为1.35(P<0.01)；通过流式细胞仪的结果显示，卡培他滨对细胞周期的影响是将其阻滞于S期，且S期细胞比例及细胞凋亡率随卡培他滨作用时间的增加而增加，具有时间依赖性，该影响作用24 h的效果最为显著；卡培他滨联合放射治疗后G2/M期细胞比例有所下降，S期细胞比例逐渐增加，CNE-2细胞周期进展得到显著阻滞。卡培他滨明显增强了放疗抑制鼻咽癌细胞生长和诱导凋亡的作用，显著提高了对肿瘤细胞的放射增敏作用。其作用机制可能是卡培他滨联合照射处理CNE-2细胞12 h后，导致DNA损伤，无法启动G0/G1期到S期的转换，将细胞阻滞在G0/G1期，引起G0/G1期比例升高；细胞照射后随着时间延长至24 h，部分细胞在某些机制的调控下能越过G0/G1期，同步化地进入下一细胞周期时相，但此时卡培他滨仍能与细胞作用，通过把周期阻滞于S期，导致S期阻滞愈来愈明显；同时，卡培他滨与CNE-2细胞长时间的作用，也减弱了损伤的DNA的修复，细胞周期进程被破坏，引起细胞合成障碍而死亡，在吉西他滨对人鼻咽癌细胞系放射增敏机制的试验中，也观察到了类似的机制[9-10]。从细胞生存曲线(图1)也可以看出，反映细胞亚致死损伤修复水平的Dq值明显降低，证明卡培他滨在减弱亚致死损伤修复的过程中发挥重要的作用。S期阻滞的后果是进G2/M期的细胞比例很少，同样引起细胞合成障碍而死亡。实验表明，即使CNE-2细胞与卡培他滨共同作用的时间相对较短，卡培他滨也能长时间与细胞作用，不但能阻滞周期进展，也能抑制损伤的DNA的修复。

综上所述，本实验初步揭示了卡培他滨对鼻咽癌CNE-2细胞系有较强的放射增敏作用，其作用机制可能与阻滞S期有关。这种低药物浓度、低放射剂量的增敏作用为临床联合放化疗治疗中晚期鼻咽癌提供了重要的依据。

[1] 郭灵,林焕新,李风岩.早期鼻咽癌希罗达增敏放疗的临床I期研究[J].中华肿瘤杂志，2004，26(4)：250-253.

[2] 李兵.Bcl-2与鼻咽癌基因治疗研究进展[J].重庆医学，2007，36(3)：220-222.

[3] 刘佳琪，胡国清. 紫杉醇和吉西他滨对鼻咽癌HNE2细胞系协同放射增敏的作用[J]. 肿瘤防治研究,2006,33(11):814-817.

[4] Al-Sarraf M, Reddy MS. Nasopharyngeal carcinoma[J].Curr Treat Options Oncol，2002，3(1)：21-32.

[5] Smalley SR, Kimler BF, Evans RG. 5-Fluoroumcil modulation of radiosensitivity in cultured human carcinoma cells[J].Int J Radiat Oncol Bio Phys,1991,20(2)：207-211.

[6] O’Connell MJ, Martenson JA, Wieand HS，et al. Improving adjuvant therapy for rectal cancer by combining protracted-infusion fluorouracil with radiation therapy after curative surgery[J].N Engl J Med，1994，331(8)：502-507.

[7] 刘晓晴，宋三泰，管忠震，等.希罗达治疗复发转移乳腺癌的临床研究[J].中华肿瘤杂志，2002，24(1)：71-73.

[8] Lawrence TS, Blackstock AW, McGinn C. The mechanism of action of radiosensitization of conventional chemotherapeutic agents[J].Semin Radiat Oncol，2003，13(1)：13-21.

[9] Kroep JR, Peters GJ, van Moorsel CJ, et al. Gemcitabine-cisplatin: a schedule finding study[J]. Ann Oncol，1999，10(12)：1503-1510.

[10] 李坚，王仁生，甘浪舸. 健择对人鼻咽癌细胞系放射增敏机制的实验研究[J]. 中国肿瘤临床,2006,33(13): 734-737.