桐粕降解菌DBTM6培养条件及降解酶活性的研究

周毅峰，邓桂芳，秦恩华

(湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

油桐(Verniciafordii)是大戟科油桐属木本植物，其主要产品是桐油，桐粕则是油桐籽榨取桐油后所剩余的副产品，桐粕中蛋白质含量为36.29%～45%(浸出法生产)，与菜籽饼粕相近，但由于含有皂苷、二萜类、佛波醇等毒素而不能高效利用[1].长期以来人们主要将其当作饼肥还田，由于饼肥在自然发酵情况下，其腐解程度完全受自然季节气候条件和时间的制约，故难以控制达到发酵饼肥腐解程度的质量，氮肥供应期延后.施用微生物发酵饼肥可改善作物的生长发育，从而改善作物品质[2].因此，通过桐粕降解菌对桐粕进行发酵，产生的蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等酶类将其中大分子物质降解为作物易吸收的小分子物质，是将桐粕开发成农作物的专用有机肥或生物有机肥的关键之一.本文在课题组前期研究基础之上，对已筛选出的桐粕降解菌DBTM6培养条件进行优化[3]，并对DBTM6菌生长代谢过程中产生的酶的活性进行初步研究，使之能够更好的运用于生产.

1 材料与方法

1.1 菌株来源

桐粕降解菌(由原文献的DBPTF1更名为DBTM1)由课题组分离保存，初步鉴定为白色短小杆菌(Curtobacteriumalbidum)[3].

1.2 培养基及原料来源

斜面完全培养基各成分质量分数(%)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，氯化钠0.5，琼脂2.0，pH7.2～7.5[4].

原料来源：玉米粉、土豆粉，购于菜市场；桐粕：由来凤县四海贸易有限责任公司提供，经丙酮脱脂后，80℃烘干，磨研，过60目筛，备用.

1.3 种子液的制备

将桐粕降解菌DBTM6从保存的斜面菌种转接于新鲜斜面培养基上，于37℃恒温培养箱中培养24 h.取一支培养好的斜面菌种，加入5 mL无菌水，用接种环将菌苔轻轻刮下，振荡，无菌水倾注于另一盛有20 mL无菌水的250 mL三角瓶(盛有数粒玻璃珠)中.然后置摇床上以160 r/min振荡20 min，制成均匀菌悬液，4℃保存备用.

表1 正交实验因素水平表(L934)

1.4 单因素试验

最佳C源的筛选：以玉米粉、土豆粉、蔗糖、葡萄糖为待选C源，培养基各成分质量百分数为：C源2.0，蛋白胨0.5，NaCl 0.5，pH 6.5～7.0，各种培养基在转速4 800 r/min下离心20min后使用. 按1%(v/v) 接种到100 mL培养基中，37℃ 200 r/min振荡培养16 h.每种培养基做3个平行，一个对照.

最佳N源的筛选：以蛋白胨、尿素、硝酸钾、硫酸铵、碳酸氢铵为待选N源，培养基各成分质量百分数为：N源0.5，蔗糖1.0，NaCl 0.5，pH6.5～7.0. 按1%(v/v) 接种到100 mL培养基中，37℃200 r/min振荡培养16 h.每种培养基做3个平行，一个对照.

最适温度的筛选：培养基成分为(%)：玉米粉2.0，蛋白胨0.5，NaCl 0.5 ，pH 6.5～7.0.按1%(v/v) 接种到100 mL培养基中，分别在30℃，35℃，40℃，45℃，50℃温度条件下，200 r/min振荡培养16 h.各种温度做3个平行，一个对照.

最适初始pH的筛选：分别制成pH为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的系列培养基，其成分同最适温度筛选的培养基. 按1%(v/v) 接种到100 mL培养基中，于37℃ 200 r/min振荡培养16 h.每种pH的培养基做3个平行，一个对照.

最适转速的筛选：按1%(v/v) 接种到100 mL培养基中，其成分和初始pH同最适温度筛选的培养基. 置摇床中分别于不同转速(120，150，180，210，240，270 r/min)下，37℃振荡培养16 h.每种转速做3个平行，一个对照.

1.5 正交实验

根据单因素实验结果，进行3水平4因素正交实验，选出桐粕降解菌DBTM6的最适生长条件.其正交实验因素水平表(L934)如表1所示.

1.6 生长量与生长曲线的测定

生长量的测定参照文献[4]进行；在最适培养条件下液体培养细菌，参照文献[4]测定不同时段的生长量，并绘制生长曲线.

1.7 粗酶液的桐粕降解活性测定

1.7.1 粗酶液的制备 将桐粕降解菌DBTM6的菌悬液按1%的接种量接种到最适培养基中.并在最适培养条件下振荡培养16 h.取出发酵液，10 000 r/min，4℃离心10 min，取上清液.加硫酸铵4℃盐析过夜.10 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清，将沉淀用少量水洗入透析袋中，透析，至BaCl2反应为阴性.将透析袋中的溶液完全转入100 mL容量瓶中，定容至刻度，该溶液即为粗酶液.

1.7.2 酶解反应 取0.6 g桐粕粉于10 mL离心管中，加入6 mL粗酶液，于37℃恒温水浴锅中反应1 h，反应过程中不时振摇离心管，反应结束立即置于沸水浴中终止反应，并做三组平行.同时做对照试验.

图1 不同碳源对DBPTF6菌生长的影响

图2 不同氮源对DBPTF6菌生长的影响

表2不同C源对DBTM6菌生长影响的方差分析(n=3，α= 0.01)

Tab.2 The variance analysis of influence for the growth of DBTM6 by adding varieties of carbon(n=3，α=0.01)

差异源SSdfMSFP-valueFcrit组间1.325630.44191164.74062.45×10-616.6944组内0.001540.0004总计1.32717

图3 不同温度对DBPTF6菌生长的影响

1.7.3 酶活性的分析检测方法 取出样品管和对照管冷却至室温后，5 000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液即为酶解液.酶解液中蛋白质含量的测定：考马斯亮蓝G-250法[5]；半乳糖醛酸含量测定：咔唑比色法[6]；可溶性氮含量测定：凯氏定氮法[6]；还原糖含量测定：3,5-二硝基水杨酸比色法[7].

2 结果与分析

2.1 最佳C源的筛选

为了解桐粕降解菌DBTM6的最佳培养条件，对影响DBTM6菌生长重要的营养成分碳源进行了筛选，结果见图1.利用Excel软件对不同碳源培养组间OD600值的差异分析发现(见表2)：在α=0.01的精度水平上，不同碳源处理组间F值远远大于F临界值，P值为2.45×10-6，证明加不同碳源对桐粕降解菌DBTM6生长有显著的影响. 利用SPSS软件对不同氮源培养组间的OD600值进行平均数分析发现：当培养基选择不同C源时，各处理组的培养液光密度(OD600)有显著性差异；培养基选择玉米粉作为C源与其他C源相比，对DBTM6菌株生长的有极显著性影响，发酵后培养液的光密度最高达到1.780 7.另外，玉米粉是DBTM6菌在设定条件下发酵生产的最适碳源.

2.2 最佳N源的筛选

对影响DBTM6菌生长重要的营养成分氮源进行了筛选，结果见图2.利用Excel软件对不同氮源培养组间OD600值的差异分析发现(见表3)：在α=0.01的精度水平上，不同氮源处理组间F值远远大于F临界值，P值为1.7711×10-9，证明不同N源对桐粕降解菌DBTM6生长有显著的影响.利用SPSS软件对不同氮源培养组间的OD600值进行平均数分析发现：当培养基中N源为小分子氮源(尿素)、硝态氮(硝酸钾)和氨态氮(硫酸铵、碳酸氢铵)时，对DBTM6菌株的生长无显著性影响；当培养基中N源为大分子氮(蛋白胨)时，其发酵培养液的OD600值最大，达到1.560 0，说明大分子氮源是最适合DBTM6菌株生长的，并其作用与其余四组相比存在极显著性差异.故本研究采用蛋白胨作为种子培养基的N源.

2.3 最适温度的筛选

温度主要通过改变酶反应速率来影响菌体的生长.为了解DBTM6菌的最适生长温度，对DBTM6菌进行了不同温度的培养试验，结果见图3.利用Excel软件对不同温度培养组间OD600值的差异分析发现(见表4)：在α=0.01的精度水平上，不同温度处理组间F值远远大于F临界值，P值为6.3712×10-5，证明不同温度对桐粕降解菌DBTM6生长有极显著的影响.利用SPSS软件对不同温度培养组间的OD600值进行平均数分析发现：当培养温度为35℃、40℃、45℃时，各组培养液的OD600值无显著性差异，在30℃和50℃时有显著性差异，菌体生长相对较差，45℃培养液的光密度最大，达到2.051 0.因此，DBTM6菌生长较适合的培养温度为35℃～45℃.

表4 温度对DBTM6菌生长影响的方差分析(n=3，α=0.01)

图4 不同pH值对DBPTF6菌生长的影响

表5初始pH对DBTM6菌生长影响的方差分析(n=3，α=0.01)

Tab.5 The variance analysis of influence for the growth of DBTM6 in varieties initial pH conditions(n=3，α=0.01)

差异源SSdfMSFP-valueFcrit组间0.804970.11503.29050.05856.1776组内0.279680.0349总计1.084515

图5 不同转速对DBPTF6菌生长的影响

表6转速对DBTM6菌生长影响的方差分析(n=3，α=0.01)

Tab.6 The variance analysis of influence for the growth of DBTM6 in different speed conditions(n=3，α=0.01)

差异源SSdfMSFP-valueFcrit组间1.940550.388124.23786.5272×10-48.7459组内0.096060.0160总计2.036511

2.4 最适初始pH的筛选

培养基初始pH的变化会影响接种后菌体生长的延迟期和生长速率，进而影响最终菌体浓度.为了解DBTM6菌的最适初始pH值，对DBTM6菌进行了不同pH值的培养试验，结果见图4.利用Excel软件对不同初始pH值培养组间OD600值的差异分析发现(见表5)：在α=0.01的精度水平上，各处理组间F值小于F临界值，P值为0.058 5，证明初始pH值对桐粕降解菌DBTM6的生长无显著的影响.利用SPSS软件对不同初始pH值培养组间的OD600值进行平均数分析发现：当初始pH值在5.0～6.5时，菌体生长速度较快，因而，初始pH选取5.0～6.5较为合适，其中以pH5.5为最好，其OD600值达到2.303.

2.5 最适转速的筛选

白色短小杆菌的发酵是需氧性发酵过程，通过改变摇床转速来调节通气量.为了解桐粕降解菌DBTM6的最适培养条件，对影响DBTM6菌生长的培养转速进行了筛选，结果见图5.利用Excel软件对不同转速培养组间OD600值的差异分析发现(见表6)：在α=0.01的精度水平上，不同转速处理组间F值大于F临界值，P值为6.527×10-4，证明转速对桐粕降解菌DBTM6的生长有极显著的影响.利用SPSS软件对不同初始pH值培养组间的OD600值进行平均数分析发现：当转速在150～270 r/min范围内，转速每提高30 r/min，对DBTM6菌株生长的影响无显著性差异，但发酵液的OD600值随着转速提高而增大，当转速为120 r/min时，与其它转速相比对DBTM6菌株生长的影响具有显著性差异，其OD600值最小.装量和转速是影响摇瓶中溶氧浓度的两个重要因素，在装量一定的情况下，在一定范围内转速越高，溶氧浓度越高.转速超过210 r/min后，容易引起菌体自溶.故桐粕降解菌DBTM6的最适转速为210 r/min.

2.6 正交试验

根据单因素实验结果，进行3水平4因素的正交试验，选出桐粕降解菌DBTM6的最适生长条件，以培养结束时的光密度(OD600)作为考察指标.根据表7分析，C源和转速是影响DBTM6菌生长较为显著的因素，根据极差分析得知对桐粕降解菌DBTM6生长影响的显著性次序为碳源>转速>pH>温度，最适生长条件为A1B3C2D2，即玉米粉2.0%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，最适温度为40℃，最适pH为6.0，最适转速为200 r/min.利用最佳的培养条件摇床培养16 h后，得到表现菌体生长情况的OD600值为2.431.

2.7 生长曲线的测定

选择适当的接种菌龄十分重要，在微生物发酵工业中，为缩短发酵周期，人们往往选择对数期的种子进行转种或扩大培养，因此在最适培养条件下测定了DBTM6菌的生长曲线.从图6可以看出：种子液接入种子培养基4 h后进入对数生长期；4～14 h细胞呈对数增长，14 h左右光密度达到最高峰.因此选择接种种龄为12～14 h，此时菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期后期，既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞数目.

表7 摇瓶培养正交试验结果(L934)

图6 DBPTF6菌株种子生长曲线

2.8 桐粕降解酶活性的初步研究

桐粕中含有丰富的纤维素、蛋白质及果胶物质[8]，为了使作物对其进行快速有效的吸收利用，需要对桐粕进行降解.为此，课题组在前期的研究中分离得到DBTM1和DBTM6两个优良菌株[3]，并发现DBTM6兼具有对桐粕纤维素降解活力、果胶物质降解活力及蛋白质降解酶活力.为了解DBTM6菌对桐粕纤维素降解能力，在DBTM6菌最适培养条件下发酵产生了粗纤维酶酶液，并进行了桐粕纤维素降解试验.纤维素酶活力单位定义在37℃条件下，每分钟降解桐粕产生1 μg葡萄糖为一个纤维素酶活力单位.其比活力定义为：每毫克酶蛋白所具有的纤维素酶活力单位数，以“U/mg”为单位.通过3,5-二硝基水杨酸比色法测定了反应液中还原糖的含量，得到该粗酶液的纤维素酶活力为3.571 7 U/mL，比活力为13.854 5 U/mg.

本文通过咔唑比色法测定了反应液中的半乳糖醛酸含量，得到该粗酶液的果胶酶活性为1.141 5 U/mL，比活力为4.427 9 U/mg.同样，通过凯氏定氮法测定了反应液中的可溶性氮的含量，得到该粗酶液的蛋白酶活性为36.358 3 U/mL，比活力为141.033 1 U/mg.

3 结论

本文采用单因素试验和正交试验选出了DBTM6菌的最佳培养基成分为：玉米粉2.0%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%；最适培养条件为：温度为40℃，pH为6.0，转速为200 r/min.

在最适培养条件下测定了DBTM6菌的降解桐粕纤维素酶活力为3.571 7 U/mL，降解桐粕果胶酶活力为1.141 5 U/mL，降解桐粕蛋白酶活力为36.358 3 U/mL，三种酶的比活力分别为13.854 5，4.427 9，141.033 1 U/mg.桐粕降解菌DBTM6含有较丰富的酶系，在其发酵桐粕过程中，各种酶活力影响桐粕降解物的得率以及腐熟桐粕施入土壤后的利用率，因此研究其酶活性是非常必要的，为桐粕更好的运用于农业生产提供依据.

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