天津地区婴幼儿诺如病毒感染的分子流行病学特征

王瑞雪 彭 林 林书祥 王 维

天津地区婴幼儿诺如病毒感染的分子流行病学特征

王瑞雪 彭 林△林书祥 王 维

目的：了解天津市地区婴幼儿诺如病毒（NV）感染情况并对诺如病毒进行基因分型分析。方法：收集2008年8月—2009年7月天津市儿童医院门诊和住院病毒性腹泻患儿的粪便标本。用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法进行检测。测序后使用Bioedit和DNAstar基因分析软件与GenBank中的参考株进行同源性分析并绘制系统进化树。结果：在540例腹泻标本中诺如病毒阳性的标本为174例，诺如病毒的阳性率为32．22%，2008年11月NV阳性率较高，为62．22%。抽取7份阳性标本进行序列分析，结果7份标本均为GⅡ－4型。结论：诺如病毒是天津地区婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体之一，GⅡ－4型是主要流行株。

腹泻,婴儿 基因型 逆转录聚合酶链反应 嵌杯病毒科 序列分析 天津

诺如病毒 （Norovirus，NV） 属于杯状病毒（Human calicivirus，HuCV），是世界范围内引起病毒性腹泻的主要病原之一[1]。自1995年方肇寅等[2]首次在我国河南省急性腹泻门诊患儿便样中发现了NV以来，我国各地相继出现关于NV暴发和流行的报道。NV感染全年均可发生，冬季高发，人群普遍易感，可在人群中暴发，主要临床表现为恶心、呕吐、腹痛和腹泻，病程一般呈自限性，传播途径以粪-口感染为主。本研究将天津市儿童医院收集的病毒性腹泻患儿粪便样本540例进行NV核酸型检测，以了解天津地区婴幼儿中NV的感染情况和基因型别。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2008年8月—2009年7月在儿童医院就诊的腹泻患儿540例，男340例，女200例。年龄0.5个月～14岁，平均14个月。患儿大便呈水样、蛋花样或稀糊样，次数较平时增多，伴或不伴发热、呕吐，有或无脱水。排除细菌、寄生虫等感染性腹泻和轮状病毒检测结果为阴性的腹泻患儿粪便标本。粪便检测前-20℃保存。

1.2方法

1.2.1病毒RNA的提取 取粪便约350 μL，加生理盐水补至1.5 mL,以5 000 r/min离心10 min，取粪便稀释标本的上清液300 μL加入500 μL Trizol（Invitrogen公司）,室温放置5 min，再加入100 μL氯仿涡旋震荡，4℃以12 000 r/min离心15 min。吸取上清液450 μL,将上清液移至新管，加冰异丙醇450 μL，颠倒混匀，室温静置 10 min。4℃以 12 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入500 μL 75%冰乙醇悬浮沉淀，4℃以12 000 r/min离心15 min。弃去上清液，离心1 min，吸取上清液，弃去，室温放10 min干燥。加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水30 μL，于 55℃～60℃温育10 min，溶解RNA。

1.2.2引物设计 采用以诺如病毒RNA多聚酶高保守区为靶序列的引物P289/P290[3]。引物序列、位置及产物长度见表1。

表1 所用诺如病毒的引物序列

1.2.3逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 采用杭州博日公司BioRT Two Step RT-PCR Kit试剂盒。逆转录体系：5×RT Buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，Oligo－dT 0．5 μL，RNase抑制剂（40 U/μL）0．5 μL，AMV 逆转录酶 0．5 μL，实验样品5.5 μL。42℃ 45 min，95℃ 5 min，冰浴 5 min。PCR 反应体系：10×RT Buffer（含 Mg2＋）2．5 μL，dNTP（10 mmol/L）0．5 μL，上游引物（5 μmol/L）0.5 μL，下游引物（5 μmol/L）1 μL，Taq 混合DNA 聚合酶 0．5 μL，RT 产物 2．5 μL，dd H2O 18 μL，总体积为25 μL，轻微离心后，放入PCR仪中扩增。反应条件：94℃3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，最后 72℃延伸5 min。PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，相对分子质量标准购自加拿大新产业公司。

1.2.4测序及分析 随机抽取7份NV阳性标本的PCR产物送天根生化科技有限公司进行序列测定。利用Bioedit和DNAstar对所获得的序列进行核苷酸同源性和基因亲缘性分析，参比序列均来自GenBank。

2 结果

2.1NV感染情况 540份标本中有174例在319 bp处出现NV特异性扩增条带，阳性率为32.22%。2008年11月NV阳性率较高，为62.22%，各月份NV阳性率见图1。

图1 2008年8月—2009年7月婴幼儿腹泻粪便标本NV阳性率

2.2NV同源性分析 见图2、3。将7份NV阳性标本的核苷酸序列与NV各基因型进行对比。其基因型编号分别为：m87661（Norwalk，GⅠ－1型），l07418（Southampton，GⅠ－2 型），u044669（Desert Shield，GⅠ－3 型），ab042808（Chiba，GⅠ－4 型），x81879（Melksham，GⅡ－1 型），u22498（Mexico，GⅡ－3型），ay502023（Farmington Hill，GⅡ－4型）。结果显示，所测的 7个序列与 ay502023（Farmington Hill，GⅡ－4型）的参考株碱基序列同源性较其他基因型高，同源性在86．7%～96．1%之间。将所测的7个序列进行遗传进化树分析，样本1与Beijing/49/2007（eu703697，GⅡ型）、Ehime5（ab447455，GⅡ－4 型）、Toyama5（ab447445，GⅡ－4型）较为接近，同源性分别为94.5%、93.5%、95.6%。样本2与Beijing/282/2005株（eu703670，GⅡ型）最为接近，同源性达98．8% 。 样 本 3、5、6 与 Beijing/133/2007 株（eu703706，GⅡ型）同源性在95%以上。样本4与Beijing/133/2007株（eu703706 GⅡ型）的同源性在90%以上。样本7与Beijing/49/2007（eu703697,GⅡ型）、Beijing/96/2007（eu703701，GⅡ型）的同源性在96%以上。所测的7个序列属于NV的GⅡ-4型，7个序列与参考序列ay502023的部分核苷酸差异。

图2 天津地区NV株RdRp遗传序列进化树

图3 所测序列与ay502023部分序列变异比较

3 讨论

NV是急性胃肠炎的主要病原，其为单股正链小RNA病毒，无包膜，具有20面体结构，直径26～30 nm。NV全长7 400～7 700 bp，分为3个开放阅读框架（opening reading frame,ORF），其中，ORF1编码一个具有保守序列的多聚酶非结构蛋白，ORF2编码一种分子质量约为56 kb的衣壳蛋白，ORF3编码一种约为22.5 kb的微小结构蛋白，该蛋白的作用与功能尚不清楚。NV基因组中ORF1的RNA多聚酶区相对保守，其他区域变异相对较多，所以此区常被用来进行基因分型。NV可分为5个基因型，其中GⅠ、GⅡ、GⅣ组易感染人。Kageyama等[4]通过分析衣壳蛋白VP1基因的S区把GⅠ和GⅡ进一步分别分为14个和17个基因型，GⅡ-4型在世界范围内广泛流行。

发展中国家每年因NV感染而住院的患者多达110万例，小于5岁的死亡婴幼儿达20万例。在发达国家每年因NV感染而住院的患者6.4万例，门诊患者 90 万例[5]。我国的济南[6]、上海[7]和北京[8]等地也有关于NV感染和流行的报道，NV检出率在16.85%～38.27%之间。

GⅡ-4型是全球NV的主要流行型[9]，且GⅡ-4型不断出现新的变异基因型,也是其近年来出现较大范围流行的原因之一。此次检测并测序的7份标本均为GⅡ-4型，这与国际流行趋势符合。7份标本的核苷酸序列与北京 2005、2007年公布于GenBank数据库的NV GⅡ-4型遗传组序列最为接近。这可能和天津与北京地理位置相邻，两地人员流动性较大有关。所测的7株NV核苷酸序列与日本 2006年的 Ehine5株 （ab447455），2006年的Toyama5（ab447445）同源性在 80.1%～96.9%，而根据Guo等[10]的报道Ehime5是2004—2005年日本NV的主要流行株之一。这是否提示有日本流行株流入北京、天津，还需进一步研究和观察。

本次监测中，NV阳性率在2008年11月—2009年2月较高，其中2008年11月NV阳性率最高。这可能与NV的增长与寒冷、人群免疫力低及新GⅡ-4抗原毒株出现有关[11]。此外，在2009年6月意大利发生的NV性胃肠炎中还同时检测出8例混合感染有轮状病毒[12]。在本次检测中亦发现1例轮状病毒阳性标本检测出现NV阳性结果，但此标本尚未测序。是否存在混合感染仍需进一步关注。

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Characterization of Molecular Epidemiology of Norovirus Infection in Infants and Young Children in Tianjin

WANG Ruixue，PENG Lin，LIN Shuxiang，WANG Wei

Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300074,China

Objective:To understand the charaterization of Norovirus(NV)infection in infants and young children in Tianjin area,and study the genotype and the genetic identity of NV.Methods:The fecal specimens were collected from infants and young children with viral gastroenteritis from Tianjin Children’s Hospital from August 2008 to July 2009.The viral RNA was amplified by a reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The amplified genes were sequenced and compared with the NV sequences deposited in GeneBank.The sequence homology was evaluated and the phylogenetic tree was generated by DNAstar and Bioedit software.Results:One hundred and seventy-four positive samples of NV were detected in 540 specimens.The positive rate was 32.22%.There was a higher NV positive rate(62.22%)in November 2008.Seven NV positive samples were selected and sequenced,showing that NV strains all belonged to GⅡ-4.Conclusion:Norovirus is one of the important diarrhea pathogens of viral gastroenteritis in infants and young children in Tianjin area and the GⅡ-4 is the major prevalent strain.

diarrhea,infantile genotype reverse transcriptase polymerase chain reaction caliciviridae sequence analysis TIANJIN

300074 天津市儿童医院（王瑞雪，彭林）；天津市儿童医院儿研所（林书祥，王维）

△通讯作者 E-mail：lpengfch@yahoo.com

（致谢：本次研究得到了天津市儿童医院儿研所及预防科各位老师的大力支持，特此表示由衷的感谢）

（2010-02-02收稿 2010-04-22修回）

（本文编辑 闫娟）

短篇与病例报告