香蕉炭疽病拮抗细菌的分离和初步鉴定

陈旭玉,甘炳春

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所海南分所海南省南药资源保护与开发重点实验室,海南万宁 571533)

植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物。内生细菌常分泌一些活性物质来促进植物生长和抵制病虫害[1]。细菌具有生长速度快,易成活等特点,从植物中分离具有抗菌活性的内生细菌用于防治植物病害是具有重要的意义。香蕉炭疽病是香蕉采后的一种重要病害,目前仍以化学杀菌剂为主,但长期使用化学杀菌剂不仅使香蕉炭疽菌产生抗药性,而且农药残留导致环境污染及威胁人类健康等,因此研究安全有效的防治措施势在必行,其中生物防治是最有应用前景的措施之一[2]。本文从药用植物中分离到2株对香蕉炭疽病具有抑制作用的内生细菌并对其进行鉴定,为以后的大田防治提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株 2008年8月至2008年10月从海南霸王岭采集健康蛇足石杉植株,从中共分离出36株内生细菌。香蕉炭疽菌(Colletordchum m uscae)由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 分离培养 将蛇足石杉冲洗干净后,用75%的酒精浸泡1 min,用无菌水冲洗3次,接着用10%的次氯酸钠浸泡5 min,无菌水冲洗3次,设立最后1次水作为对照,涂布于培养皿中,如无菌落产生,说明材料消毒彻底,否则不能保证是内生细菌。将植株转入无菌研钵中研磨匀浆,加5 mL水于研钵中静置30 min,以此为母液,稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度悬液。取20μL于PDA平板中涂布,每个处理重复3次。最后根据菌落形态、颜色等挑取不同的菌落。

1.2.2 室内拮抗性测定 采用对峙培养法,首先在培养皿中央接种香蕉炭疽菌菌块,直径为5 mm,27℃恒温培养24 h,然后在平板的4角分别接分离菌株,在平板的4角接灭菌的蒸馏水作为对照,27℃恒温培养72 h,共同培养至出现抑菌圈。测量各分离菌菌落边缘和香蕉炭疽菌菌落边缘之间的抑菌带宽度,选出拮抗作用明显的细菌进一步作拮抗菌株试验。

1.2.3 16S r DNA片断扩增和序列分析 ①16S rDNA片断扩增：以扩增细菌DNA为模板,16S rDNA为引物。正向引物：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′,反向引物：5′-TACCTTGTTACGACT T-3′。总体积25μL的反应体系：模板(细菌DNA)0.5～1μL,正向引物(10 mol/L)1μL,反向引物(10 mol/L)1μL,2×MasteerMix 12.5μL,ddH2O 10μL。反应条件：预变性95℃5 min;变性94℃30 s,50℃30 s,72℃10 min,30个循环;最后72℃延伸10 min;②DNA序列测定及分析：PCR产物由北京三博远志生物技术有限公司进行测序,将获得的序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性比较。并采用软件MEGA 4.0的邻近相连法(Neigh-Joining)构建系统发育树。

2 结 果

2.1 拮抗菌PCR扩增

经过琼脂糖凝胶电泳检测,基因组DNA扩增得到的16S rDNA核苷酸片段与DL2000Mark比较,约在1 500 bp处出现特异性条带,其分子量大小与16S rDNA编码区域的片段长度相吻合(见图1、图2)。

2.2 测序及序列分析

为了进一步确定菌株的分类学地位,测定其16S rDNA的基因序列,测出的序列分别为1 081 bp和398 bp。JXS1-6和AHL1-1序列与NCB I(http：//www.ncbi.n lm.nih.gov)上相似序列比对结果表明：JXS1-6与B urkholderiacepacia(AM711586)的序列相似性为95%,AHL1-1与B urkholderia cepacia(GU998815)的序列相似性为99%。菌株JXS1-6、AHL1-1与GenBank中相似性较高的10株菌株采用MEGA 4.0软件构件系统发育树见图3。分析显示：拮抗菌JXS1-6、AHL1-1和B urkholderia cepacia的6株代表菌株聚在一支并且支持率为100%。通过序列系统发育分析初步判断拮抗菌JXS1-6和AHL1-1属于伯克氏菌属(B urkholderia),伯克氏菌科(Burkholderiaceae),伯克氏菌目(Burkholderiales),β-变形菌纲(Betaproteobacteria)。

图3 拮抗细菌JXS1-6和AHL1-1序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree generated by the neighbor-joiningmethod based on the DNA sequences

2.3 JXS1-6和AHY1-1对香蕉炭疽病的抑制作用

JXS1-6和AHL1-1对香蕉炭疽病有抑制作用,前者的抑制作用更加明显。由图4看出,JXS1-6和AHL1-1菌株在培养基上均可产生明显的抑菌带,带宽分别为9 mm、4 mm,这说明JXS1-6和AHL1-1菌株的某些分泌物可抑制香蕉炭疽病病原菌的生长。

图4 2株拮抗细菌对香蕉炭疽菌的抑制作用Fig.4 Inhibition effect of two strain JXS1-6 and AHL1-1 onColletotrichum musae

3 讨 论

香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)是一种引起香蕉采后病害的最重要病原,目前主要是用生防菌(如枯草芽胞杆菌[3-4]、链霉菌[5]、假单胞杆菌等[6])和海藻蛋白[7]、荔枝草[8]、艾蒿[9]等植物活性物质对香蕉炭疽病进行生物防治。从药用植物蛇足石杉中分离内生细菌伯克霍尔德属(B urkholderia)防治香蕉炭疽病是第一次报道。

随着分子生物学的发展,ITS序列和系统发育学分析在细菌鉴定中越来越得到广泛的应用。虽然传统的鉴定方法已经比较完善,但是由于鉴定步骤繁多、耗时长和主观判断的干扰给鉴定工作带来误差[10]。本文从珍贵药用植物蛇足石杉中分离到2株具有拮抗作用的内生细菌,并通过ITS序列分析和系统发育树进行分类地位的划分,这2株对香蕉炭疽病具有拮抗作用的内生真菌均鉴定为伯克氏菌属(Burkholderia)。

伯克氏菌属是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰阴性细菌,并且具有多种特有的功效,能分解土壤中残留的农药、净化污水,降解油脂等。如秦华明等[11]从长期受油污染的土壤中分离筛选得到的Burkholderia cepaciaX4菌株能高效降解油脂。B urkholderia还能促进植物的生长,常作为生防菌,如杨森等[12]从土壤中分离1株B urkholderia对小麦赤霉、烟草赤霉、马铃薯干腐、西瓜枯萎,及棉花、番茄、酥梨病害的霉菌有明显的抑制作用。Jin Hong[13]也从土壤中分离1株对植物真菌病害有作用的Burkholderia菌株。牟志美等[14]从健康桑叶片中分离到B urkholderia并在桑树体内定殖,发现在定植的过程中菌株的拮抗性能未改变。

本实验从药用植物筛选出的菌株JXS1-6和AHL1-1对香蕉炭疽病有很强的抑制作用,但其拮抗机制及产生的拮抗物质及其在香蕉中的定殖能力如何等尚有待于进一步研究。

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