弧菌显色培养基 (Chrom I D Vibrio)对霍乱弧菌检测效果的探讨

沈飚 胡兴娟 汪云泉 徐君辉

(舟山出入境检验检疫局 浙江舟山 316000)

1 前言

霍乱弧菌引起的急性肠道传染病,是一种重要的食源性致病菌,在全球爆发了多次大规模的疫情,直接危害人类的健康[1]。随着食品生产和国际贸易的迅速发展,霍乱弧菌检测成为了食品安全与质量检测的重要指标。目前国内普遍采用的培养基只适用于霍乱弧菌的选择性分离培养,不能特异性检出霍乱弧菌,因此用显色培养基检测细菌是一种新的快速方法。

显色培养基原理是将微生物胞内酶的种类及反应条件作为微生物分类鉴定的主要依据,通过在分离培养基中加入微生物特异性酶的底物,该底物由发色基团和微生物可代谢物质组成,通常无色,但在特异性酶作用下游离出发色基团并显示一定颜色,直接观察菌落颜色就可对菌种做出鉴定,减少了对菌株进行纯培养和进一步生化鉴定的步骤[2]。

本文通过比较 Chrom I D Vibrio和 TCBS培养基,对 Chrom I D Vibrio培养基的灵敏度、特异性和检测效果进行了初步探讨。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 培养基及试剂

ChromI D Vibrio显色培养基 (生物梅里埃 842043001)、TCBS培养基 (北京路桥 080425)、营养琼脂、碱性蛋白胨水、霍乱弧菌生化鉴定管、生物梅里埃V ITEK GN卡、API鉴定条等。

2.1.2 菌株

副溶血弧菌,非 O1霍乱弧菌,溶藻弧菌,创伤弧菌,拟态弧菌,大肠杆菌,河流弧菌,伤寒沙门氏菌,单增李斯特菌,金黄色葡萄球菌等阳性菌株。

2.1.3 主要仪器设备

恒温培养箱、高压灭菌锅、电子天平、显微镜、-80℃超低温冰箱、生物梅里埃 V ITEK细菌鉴定系统、均质器、混匀器等。

2.2 方法

2.2.1 培养基配制

TCBS培养基的配制按生产厂家说明书进行,Chrom I D Vibrio显色培养基为成品。

2.2.2 显色培养基特异性

副溶血性弧菌、非 O1霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌采用 2%氯化钠营养琼脂复苏,单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌用脑心浸液琼脂复苏,大肠杆菌、沙门氏菌用营养琼脂复苏,复苏 20h后用接种环分别划线接种 Chrom I D Vibrio和 TCBS平板,36℃培养 18～24h,观察各个菌株在显色培养基上的生长情况。

2.2.3 显色培养基灵敏度

将非 O1霍乱弧菌大约 3.0×108cfu/mL的增菌液进行 10倍梯度稀释,用移液管吸取 10-5～10-8稀释度菌液各 l mL,分别涂布 Chrom I D Vibrio和TCBS平板,每个平板设 3次重复,36℃培养 18～24h后进行平板计数,比较各培养基的灵敏度。

2.2.4 人工污染样品检验

将非 O1霍乱弧菌大约 3.0×108cfu/mL的增菌液进行 10倍梯度稀释,用移液管吸取 10-5～10-8稀释度菌液各 1mL分别加入到 10g鱼肉 (阴性样品)中,混匀,按照 SN1022-2001检验程序,取 1环增菌液划线接种 Chrom I D Vibrio和 TCBS平板,36℃培养18～24h,观察霍乱弧菌的检出情况。

2.2.5 实际样品检验

采集鱼肉、鱼鳃、虾、贝类等共 300份,按采样规范剪刀取 25g样品加入 225 mL2%氯化钠碱性蛋白胨水中增菌培养 6～8h和 18～24h,分别取 1环增菌液划线接种 Chrom I D Vibrio和 TCBS平板,36℃培养 18～24 h,观察。

2.3 鉴定

疑似菌落采用法国生物梅里埃 V ITEK细菌鉴定系统 GN卡,API、结合传统生化方法进行鉴定。

3 结果

3.1 显色培养基特异性检测结果

不同菌株在培养基上的生长情况如表 1所示。在 Chrom I D Vibrio平板上,副溶血性弧菌、河流弧菌呈现粉红色菌落,非 O1霍乱弧菌、创伤弧菌呈现蓝色或者蓝绿色菌落,拟态弧菌、溶藻弧菌呈无色菌落,大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌等杂菌或生长很差或被抑制;在 TCBS平板上,副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌都呈现蓝绿色菌落,非 O1乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌都呈现黄色菌落,其他杂菌基本不能生长。

表 1 ChromI D Vibrio培养基检测霍乱弧菌特异性实验

3.2 显色培养基灵敏度检测结果

采用非O1霍乱弧菌纯菌液涂布各平板结果如表 2,非O1霍乱弧菌纯菌液涂布计数结果约为 3.0×108cfu/mL的增菌液,稀释度为 10-5～10-7的Chrom I D Vibrio、TCBS平板上均能生长,平板灵敏度无明显差异,在稀释度为 10-8时,Chrom I D Vibrio能检测出目标菌,而 TCBS平板未能检测。所以 Chrom I D Vibrio培养基的灵敏度比 TCBS的灵敏度要高,检测效果比 TCBS好。

表 2 ChromI D Vibrio和 TCBS检测霍乱弧菌敏感度对比试验

3.3 人工污染样品检验结果

非O1霍乱弧菌纯菌液涂布计数结果约为 3.0×108cfu/mL的增菌液,稀释度为 10-5～10-7的纯菌液污染鱼肉后,检测结果表明,稀释度 10-5～10-6在 Chrom I D Vibrio和 TCBS平板上都可以检出,即当样品中大约有 300cfu/mL浓度的目标菌时,经过选择性增菌培养,在 2种培养基上都可以检出,稀释度 10-7时 Chrom I D Vibrio有检出、TCBS平板未检出。

3.4 采集的 300份实际样品进行检测情况

采集的 300份实际样品中,包括冻鱼肉、带壳虾、冻蟹贝等水产品,用 Chrom I D Vibrio与 TCBS检测,均未检出目标菌。

4 讨论

近年来,世界各地不断发生微生物引起的食物中毒事件,各国对食品卫生安全的重视程度越来越高,微生物检测力度也在逐步加强。传统的检测方法费时费力,已经不能满足食品卫生安全质控的需求,人们不断尝试和改进检验技术和方法。目前对于显色培养基的研究已广泛被应用于检测沙门氏菌[3]、单核增生李斯特菌[4]、大肠杆菌[5]、金黄色葡萄球菌[6]、副溶血弧菌[7]等致病菌。

本文中 Chrom I D Vibrio培养基根据弧菌,特别是霍乱弧菌特殊培养条件,加入了选择性抑菌剂,可以保障霍乱弧菌优先生长,抑制其他干扰菌的生长。大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌均被抑制,具有较好的特异性。与 TCBS相比,减少了干扰性可疑菌株河流弧菌。但霍乱弧菌和创伤弧菌颜色基本相同,需要用其他生化反应的方法区分。通过敏感性试验发现 Chrom I D Vibrio的对霍乱弧菌的敏感性高于 TCBS。

综上所述梅里埃弧菌显色培养基具有良好的灵敏性和特异性,在人工污染样品的检测中,比TCBS平板灵敏性、特异性要好。

[1] 谈荣梅,陈坤.霍乱流行病学研究现况[J].海峡预防医学杂志,2004,10(1):25～27.

[2] 卢汉兴,车光,王红,等.显色培养基在微生物检验初筛中的应用[J].广西预防医学,2001,7(1):44～45.

[3] 杨兰萍,许学斌,姚宗蓓,等.CHROMager显色培养基分离沙门菌的初步应用和评估[J].检验医学,2005,20(1):52～54.

[4] 张淑红,吴清平,张菊梅.显色培养基在单核细胞增生李斯特菌快速检测中的应用研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(1):43～45.

[5] Mammad Manafia,Birgit Krems maierb.Comparative evaluation of different chromogenic/fluorogenic media for detecting Escherichia coliO157:H7 in food[J].International Journal of FoodMicrobiology,2001,71(2-3):257～262.

[6] 黄汝添,吴清平,张菊梅,等.金黄色葡萄球菌显色培养基研究进展[J].中国卫生检验杂志,2007,17(6):1148～1150.

[7] Su Y C,Duan J,WuWH.Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticust[J].J Food Prot,2005,68(7):1454～1456.