利用响应面分析方法优化生防细菌B579增殖培养基

杨秀荣,王雪莲,王 敏,孙淑琴,刘水芳

(1.天津市植物保护研究所,天津 300112;2.天津科技大学生物工程学院,天津 300457)

从天津近郊蔬菜种植区分离筛选获得1株生防细菌B579,经初步鉴定为芽胞杆菌属(B acillus spp.),试验表明该菌在室内平皿抑菌试验和温室盆栽试验中均对土传病害表现出明显的防治效果[1],本研究旨在利用Plackett-Bur man和响应面等实验设计确定及优化该菌增殖的培养基[2],使单位体积活菌数增加,为后续的放大培养提供依据。Plackett-Burman设计法是一种2水平的实验设计方法,它可以利用最少的实验次数,从众多的考察因素中快速有效地筛选出主要的影响因子,因而被广泛应用于因子主效应的估计中[3]。响应面法(Response Surface Methodology,RS M)是一种优化生物过程的综合技术,采用该法可以建立连续变量曲面模型[3-4],对影响生物产量的因子水平及其交互作用进行优化与评价[4-5]。因此,它可快速有效地确定生物过程的最佳条件,该法已被广泛用于培养基优化实践中[5-6]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 生防细菌B579从天津近郊蔬菜种植田分离获得,现保存于天津市植物保护研究所生防室。

1.1.2 培养基(g/L) ①PDA培养基：马铃薯

200,葡萄糖(或蔗糖)20,琼脂18,pH自然;②肉汁胨培养基：牛肉浸膏3,蛋白胨10,NaCl 5,pH 7.2;③LB培养基：蛋白胨10,酵母提取物5;NaCl 10;pH 7.2;④Plackett-Burman实验发酵培养基：按照实验设计配制;⑤RS M实验发酵培养基：同上。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶发酵实验 将斜面培养1周的生防细菌B579接种到装液量为30 mL的250 mL三角瓶中,37℃、180 r/min摇床培养12 h,使菌体处于对数生长期。然后以一定的接种量接种到发酵培养基中,在摇床转速为180 r/min和合适的温度条件下恒温培养24 h。

1.2.2 生防细菌B579菌体量的测定 将发酵液稀释100倍后,在600 nm下用分光光度计测量其浊度。

1.2.3 Plackett-Bur man实验设计 根据生防细菌B579生长所需营养的基本原则,结合相关文献和前期的实验,本实验选取的影响因素共10个。因此,选用了N=12的PB设计表,各参数及其水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素水平及编码Table 1 Level and code of variables for Plackett-Burman design

1.2.4 最陡爬坡实验设计 根据拟合的一阶模型回归系数的符号和大小来设计显著因素的最陡上升路径,而其他因素的取值则根据Plackett-Burman实验结果中各因素效应的正负和大小,正效应的因素均取较高值,负效应的因素取较低值[15]。

1.2.5 Box-Benhnken中心组合设计优化培养基根据最陡爬坡试验结果,确定下一步试验水平的中心点和各水平的步长。选取响应值为菌体量,自变量为显著因子的水平,借助实验设计软件SAS,进行Box-Benhnken设计。

1.2.6 菌体数量的测定(活菌的计数法) 将发酵液在无菌条件下10倍稀释至10-7、10-8、10-9,并将此3个稀释度在无菌条件下,吸取1 mL于无菌平板中,每稀释度重复3次。将灭菌后冷至不烫手的平板计数培养基倒入平板中(10～12 mL),迅速旋转平板,混匀后使培养基铺满整个平板,凝固后倒置平板于30℃培养箱中,20 h后取出查菌落数。

2 结果与分析

2.1 影响生防细菌B579增殖的重要因素

Plackett-Bur man试验结果见表2,各因素方差分析见表3。从表3的概率P值大小可看出,对生防细菌B579菌株发酵液中的菌体量具有显著影响的因子是黄豆饼粉、玉米粉和牛肉膏,考虑这3个因素的效应(t值)大小,确定它们为下一步试验的关键因素。由于其他因子对响应值影响均不显著,因此,在进一步筛选时正效应的因素均取较高值,负效应的因素取较低值。

表2 N=12的Plaekett-Burman实验设计与响应值表Table 2 Design and response of N=12 Plackett-Bur man test

2.2 最陡爬坡试验

表4列出了显著因素的变化方向、步长和试验结果。由表4可知,菌体量在0到(0+1Δ)之间有一个明显的上升,之后开始下降,培养基成分最佳含量在(0+1Δ)和(0+2Δ)之间,故以(0+1Δ)条件为后续试验中心点。

表3 Plackett-Burman试验各因素参数分析Table 3 The parameter estimates of variables of Placktt-Burman design

表4 最陡爬坡实验设计及结果Table 4 Experimental designs and the results of steepest ascent

2.3 Box-Benhnken实验数据的确定

依据Plackett-Bur man实验结果及最陡爬坡试验,选取黄豆饼粉、玉米粉、牛肉膏作为响应面设计的变量,各因子及其编码见表5,进一步借助实验设计软件SAS,进行Box-Benhnken设计。

2.4 Box-Benhnken实验设计

依据Box-Benhnken设计所得响应值结果见表6,回归方程中回归系数估计值见表7,最终拟合的二次回归方程式为：Y1=0.222-0.000 625 X1-0.000 125X2-0.000 5X3-0.011 375X1X1-0.001 25X1X2-0.01X1X3-0.006 375X2X2-0.001 5X2X3-0.009 125X3X3,通过模型的可信度分析(见表8),R2=0.997 3,离回归标准差为0.000 671,说明该回归方程的拟合程度较好。

表5 Box-Benhnken设计各因子及其编码值Table 5 Assigned concentration of each variable at different levels in Box-benhnken design

表6 Box-Benhnken试验设计方案及响应值Table 6 Design and response of Box-Benhnken

表7 回归方程中回归系数的估计值Table 7 Coefficient estimated value in regression equationdesign

表8 模型可信度分析Table 8 Reliability analysis in model

2.5 数据分析图

依以上回归方程绘制分析图,可得图1、图2、图3,从各图可以看出,X1、X2和X3存在极点值。运用SAS对回归模型进行规范性分析,寻找最优相应区,分析可知,回归模型存在稳定点(X1、X2、X3)为(30.2、31和23.5 g/L)。这说明X1(玉米粉)的最佳范围为31 g/L,X2(牛肉膏)的最佳范围为23.5 g/L,X3(黄豆饼粉)的最佳范围为30.2 g/L。

图1 Y=f(X1X2)响应面立体图Fig.1 The stereogram of Y=f(X1X2)response surface analysis

图2 Y=f(X1X3)响应面立体图Fig.2 The stereogram of Y=f(X1X3)response surface analysis

2.6 验证试验

由以上试验得到最优配方：黄豆饼粉、玉米粉、牛肉膏分别在30.2、31和23.5 g/L的条件下,可使生防细菌B579获得最大菌体量,验证试验证实了该方程的预测值与实际值之间吻合较好。优化后的培养基使菌体量从起始LB培养基的7.3×109cfu/mL提高到8×1011cfu/mL,见表9。

图3 Y=f(X2X3)响应面立体图Fig.3 The stereogram of Y=f(X2X3)response surface analysis

表9 最优培养条件下生防细菌B579菌量值Table 9 The number of bacteria in good condition

3 讨 论

传统的数理统计方法(线性回归分析和正交试验设计)在工农业生产和科学研究中有着广泛的应用。但存在一些缺点：线性回归分析虽然可以利用实验数据得出因素与指标(即响应值)之间的回归方程,但要求数据量大,费时耗资,且只是讨论一种因素的影响,无法综合考虑几种因素的综合作用。正交试验设计则注重如何科学合理地安排试验,可同时考虑几种因素,寻找最佳因素水平组合;但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式,即回归方程。从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。因此期望找到一种试验次数少、周期短,求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用的回归分析方法,响应面分析方法在很大程度上满足了这些要求,该方法既经济省力,优化效率又高,且处理数据由计算机完成。数据中隐含的规律用立体图直观表示出来,并用数学模型描述,从而揭示深层次的规律。本文利用该方法获得以黄豆饼粉、玉米粉、牛肉膏为主要影响因子的培养基及最佳配比,为生防细菌B579的进一步研究与开发应用奠定了基础。

RSA有许多方面的优点,但它仍有一定的局限性。首先,如果你将因素水平选的太宽,或选得关键因素不全,将会导致响应面出现吊兜或鞍点,因此试验前进行充分的调研和预备性试验是非常必要的。而且通过回归分析得到的结果只能对该类试验作估计。此外,当回归数据用于预测时,只能在因素所限的范围内进行预测。

[1] 杨秀荣,王雪莲,王敏,等.生防细菌B579对土传病害的防治效果及促长作用[J].中国生物防治,2008,24(增刊)：59-61.

[2] 徐子钧,李剑,梁凤来,等.利用SAS软件优化L-乳酸发酵培养基[J].微生物学通报,2004,31(3)：85-87.

[3] Kalil S J,Maugeri F,Rodrigues M I.Response surface analysis and simulation as a tool for bioprocess design and optimization[J].Process Biochemistry,2000,35：539-550.

[4] 王允祥,吕凤霞,陆兆新.杯伞发酵培养基的响应曲面法优化研究[J].南京农业大学学报,2004,27(3)：89-94.

[5] 刘建忠,熊亚红,翁丽萍,等.生物过程的优化[J].中山大学学报,2002,41(增刊)：132-137.

[6] Ramkrishna S,Swaminmhan T.Response surface modeling and optimization to elucidate and analyze the efects of inoculums age and size on surfactin production[J].Biochemical Engineering Journal,2004,21：141-148.