耐力运动对ApoE基因敲除小鼠一氧化氮系统的影响及其对AS形成的干预作用

张洪侠2，刘善云李宁冯红王洪涛王敏徐新女，王金环

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耐力运动对ApoE基因敲除小鼠一氧化氮系统的影响及其对AS形成的干预作用

张洪侠1，2，刘善云1，李宁1，冯红1，王洪涛1，王敏1，徐新女3，王金环3

目的：以ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠为动脉粥样硬化（AS）模型，观察耐力训练对ApoE-/-小鼠AS形成的干预作用及NO系统的影响，以探讨耐力运动抗AS的可能机制。方法：将24只8周龄ApoE-/-小鼠随机分为AS模型组和运动干预组，每组12只，运动组在活动跑台上进行耐力训练，实验持续14周后，测定两组小鼠主动脉斑块面积及病理变化、血清NO和血脂水平以及主动脉iNOS和eNOS蛋白表达。结果：运动组小鼠主动脉斑块面积显著小于对照组（P＜0.01），血管壁及内膜损伤程度较对照组减轻，血清NO浓度和主动脉eNOS蛋白表达显著高于对照组（P＜0.01），i-NOS蛋白表达显著低于对照组（P＜0.05），血脂水平两组间无显著差异。结论：耐力运动通过增加eNOS蛋白表达、抑制iNOS蛋白表达和提高血中NO水平而发挥抗动脉粥样硬化的作用。

耐力运动；ApoE基因敲除小鼠；动脉粥样硬化；一氧化氮；一氧化氮合酶

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是严重危害人类健康的疾病之一。一般认为，AS的发生发展是多种遗传因素和环境因素相互作用的结果。近年研究显示，AS是血管内皮损伤后的一种慢性炎症反应过程，而一氧化氮（NO）功能低下与血管内皮损伤及慢性炎症反应有着密切的关系[1]，因而成为AS发病机制中一个新的研究热点。许多研究表明，NO合成不足或其利用率降低与AS的形成、发展及其并发症的发生密切相关[1-2]。

运动锻炼是防治动脉粥样硬化及其并发症的有效措施。已有研究发现，运动能有效地调节NO合成及一氧化氮合酶（NOS）的表达、增强NOS活性等[3-6]，提示运动通过改善NO/NOS系统机能而对动脉粥样硬化防治产生有益的影响。本研究以ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠为研究对象，在复制实验动物AS模型的基础上，深入探讨耐力运动对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的干预效果及对机体NO/NOS系统的影响，以阐明耐力运动对动脉粥样硬化影响的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养

选取8周龄ApoE-/-小鼠24只，雄性，体重20～22 g，购自北京大学医学部实验动物中心，饲以“西方类型”膳食（胆固醇0．15%，脂肪21%），二级条件饲养。将各组小鼠分别在层流架中分笼饲养，每笼3～5只，自由进食进水。实验室环境温度保持在22～24℃，相对湿度为50%，光照时间12 h/天。

1.2 动物分组及训练方案

将实验动物随机分为AS模型组（安静对照组）和运动组，每组12只。运动组在活动跑台上适应性训练一周后，于每日上午9～10时进行耐力训练，依据加拿大学者Fernando等[7]的研究资料，确定小鼠运动强度范围，跑台速度为13 m/m in，5天/周，1 h/天。实验持续14周。

1.3 取材及组织处理

实验周期结束将所有小鼠处死，禁食过夜（运动组停止运动24 h，以消除最后一次运动的急性效果）。采取眼球摘除法取血，离心分离血清，置-20℃保存。取血后迅速打开胸腔，暴露心脏和主动脉，从心尖部用注射器注入DEPC水进行冲洗，剪开右心耳以便流出冲洗液，慢速注入。取出全心脏（包括主动脉弓），以制备主动脉冰冻切片。

1.4 各指标测定与方法

1.4.1 血脂的测定甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）采用酶比色法测定；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）采用沉淀法测定。血脂测试试剂盒购自北京中生生物工程公司。

1.4.2 血清一氧化氮的测定采用硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）。使用722分光光度计，在550nm波长处测定样品反应后的吸光度，计算NO含量。NO测试试剂盒购自南京建成生物技术有限公司；一氧化氮合酶（iNOS、eNOS）抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.4.3 主动脉斑块面积评估（油红O染色）及组织形态学观察（HE染色）主动脉根部冰冻切片的制作：取出小鼠心脏连同主动脉，剥离血管外附着组织进行固定后用O．C．T包埋，连续切片，切片厚度7μm/张，在显微镜下选择切片，选取主动脉横断面出现三个主动脉瓣膜时起至瓣膜消失。每间隔10张取一张，共5张参与斑块面积评估，采用油红O染色，利用计算机图像分析Leica Qwin V3系统对主动脉斑块面积进行估算，参照Suzuki等[8]方法，主动脉斑块以斑块面积/管腔总面积的比值来表示。另取12张切片进行HE染色，显微镜下观察主动脉病理变化。

1.4.4 主动脉iNOS、eNOS蛋白表达的检测主动脉iNOS、eNOS蛋白表达采用免疫组化PV法进行测定，表达强度用组织学评分表示。每组切片随机选取5个视野（400×），计数阳性染色细胞所占视野内总细胞百分比作为iNOS、eNOS的表达强度。棕黄色颗粒为目的蛋白表达阳性着色部位，蓝色为苏木素复染细胞核着色，阳性部位主要在胞桨。

1.5 数据处理

所有实验数据均由SPSS统计软件（SPSS11．5）处理，结果以均值±标准差（）表示，采用独立T检验，显著性水平为0．05和0．01。

2 结果

2.1 ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积的变化

8周龄ApoE-/-小鼠经14周“西方类型”膳食饲养至22周龄时，主动脉切片经油红O染色在显微镜下观察可见，AS模型组和运动组小鼠主动脉均有不同程度的被染成红色的脂质斑块。与模型组相比，运动组小鼠主动脉斑块面积显著低于模型组（P＜0．01），见表1、图1。表明在本实验中耐力运动延缓了实验动物动脉粥样硬化的形成。

表1 ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积（）Table 1 The square ofaorta plaque in ApoE-deficientm ice（）

表1 ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积（）Table 1 The square ofaorta plaque in ApoE-deficientm ice（）

注：**与模型组相比P＜0.01（下同）。

/只斑块面积/μm2管腔总面积/μm2斑块面积/管腔总面积/%模型组12 288 267.00±组别样本数68 654.61 691 238.70± 128 603.31 41.79±6.93运动组12 131 678.90± 39 061.29 467 816.60± 132 568.37 25.07±7.04**

2.2 ApoE-/-小鼠主动脉病理形态学变化

22周龄ApoE-/-小鼠主动脉冰冻切片经HE染色显微镜下观察显示，AS模型组小鼠主动脉内膜明显增厚，可见大量泡沫细胞形成的脂纹期病变和纤维期病变，并有炎性细胞浸润。结果提示，模型组小鼠已发生明显的AS病变。与AS模型组相比，运动组小鼠主动脉病变相对较轻，多为脂纹期病变。提示，耐力运动能有效地抑制或减轻ApoE-/-小鼠AS病变程度。

图1 两组小鼠主动脉冰冻切片油红O染色的比较（放大倍数：40、100倍）Figu re 1 The com parison ofaortic change w ith OilRed O staining using frozen section between m ice of two groups

2.3 ApoE-/-小鼠血脂的变化

由表2可见，经14周耐力运动干预后，血清TC、TG、HDLC和LDL-C等指标两组间均无显著性差异。提示耐力运动对ApoE-/-小鼠血脂水平未产生明显影响。

表2 ApoE-/-小鼠血脂的变化（）Table 2 The change ofblood lipid in ApoE-deficientm ice（）

表2 ApoE-/-小鼠血脂的变化（）Table 2 The change ofblood lipid in ApoE-deficientm ice（）

HDL-C /mmo·/L-1模型组10 16.79±3.73 1.51±0.30 15.12±2.82 0.98±0.29运动组10 16.87±3.89 1.25±0.25 15.49±3.64 0.79±0.20组别样本数TC/mmol·L-1 TG/mmol·L-1 LDL-C /mmol·L-1

2.4 ApoE-/-小鼠血清NO的变化

由表3可见，经14周耐力运动干预后，运动组小鼠血清NO水平显著高于模型组（P＜0．05）。提示运动可以改善血管内皮功能，提高NO水平。

表3 ApoE-/-小鼠血清NO的变化（）Table 3 The change ofserum NO in ApoE-deficientm ice（）

表3 ApoE-/-小鼠血清NO的变化（）Table 3 The change ofserum NO in ApoE-deficientm ice（）

注：*与模型组相比P＜0.05。

组别样本数/只血清NO/μm·L-1模型组10 53.39±5.87运动组10 63．79±7．58*

2.5 ApoE-/-小鼠主动脉iNOS、eNOS蛋白表达的变化

经14周耐力运动干预后，运动组小鼠主动脉iNOS蛋白表达显著低于模型组（P＜0．01）；而eNOS蛋白表达显著高于模型组（P＜0．01），见表4、图2、图3。

表4 ApoE-/-小鼠主动脉iNOS和eNOS蛋白表达（）Table 4 The protein expression ofaortic iNOS and eNOS in ApoE-deficientmice（）

表4 ApoE-/-小鼠主动脉iNOS和eNOS蛋白表达（）Table 4 The protein expression ofaortic iNOS and eNOS in ApoE-deficientmice（）

组别样本数/只iNOS/%eNOS/%模型组12 48.29±2.33 34.93±7.63运动组12 27.98±3.25**56．98±6．84**

图2 两组小鼠主动脉iNOS蛋白表达的比较Figure 2 The com parison of protein exp ression ofaortic iNOS betweenmice of two groups

图3 两组小鼠主动脉eNOS蛋白表达的比较Figure 3 The com parison of protein exp ression ofaortic eNOS betweenm ice of two groups

3 讨论

近年来，有关动脉粥样硬化干预手段及其机制的研究日益受到关注。本研究对运动干预ApoE基因敲除小鼠AS形成及作用机制方面进行了深入探索，并获得了一些有益的结果。

3.1 耐力运动对ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积及病理变化的影响

采用基因敲除技术培育成功的ApoE基因敲除小鼠是目前AS研究领域中应用最为广泛的基因工程动物，已成为探讨AS发生发展机制和治疗措施等理想的实验动物模型[9]。本研究显示，8周龄ApoE-/-小鼠经14周“西方类型”膳食饲养至22周龄时，AS模型组（安静对照组）小鼠主动脉内膜脂质沉积广泛，主动脉斑块面积占管腔面积的比例达（41．79±6．93）%；主动脉切片HE染色显示，模型组血管内膜损伤严重，可见大量由泡沫细胞形成的脂纹期和纤维斑块期病变。结果表明，22周龄ApoE-/ -小鼠已形成动脉粥样硬化。

通过14周耐力运动干预显著抑制了ApoE-/-小鼠AS斑块的进展，运动组小鼠主动脉斑块面积显著低于对照组，并且主动脉内膜损伤较轻。表明耐力运动延缓了ApoE-/-小鼠AS斑块的形成和病变程度，为耐力运动能有效地预防AS发生提供了实验依据。

3.2 耐力运动对ApoE-/-小鼠血脂的影响

本实验显示，经过14周耐力运动干预后，运动组小鼠血清TC、TG、LDL、HDL水平与模型组之间无显著性差异，表明14周中等强度的耐力运动干预对ApoE-/-小鼠血脂未产生明显影响，这与近年来一些研究报道相一致[10-12]。我们认为，ApoE的缺失可能是造成运动对ApoE-/-小鼠血脂影响不显著的原因之一。研究结果提示，耐力运动对ApoE-/-小鼠AS的影响可能存在着血脂之外的其它机制。

3.3 耐力运动对ApoE-/-小鼠NO/NOS系统的影响及其在抗AS中的作用

近年来，NO在AS发生发展中的作用日益受到重视。内皮细胞功能障碍是AS的一个早期特征，表现为血管源性的NO产生减少及炎性细胞粘附分子表达增加。NO由L-精氨酸（L-Arg）在一氧化氮合酶（NOS）的催化下生成。NOS有三种亚型：神经元型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）、诱导型NOS（iNOS）。内皮细胞表达的eNOS参与产生少量的NO，具有抗血小板聚集及抑制白细胞粘附等多种功能；iNOS可被某些炎症介质诱导产生大量的NO，加重炎症反应对机体造成的损害。研究表明，动脉粥样硬化时NO合成减少，其生物学作用下降，eNOS表达下降、活性降低，而iNOS表达增强[1-2]。提示血管内皮细胞产生NO减少导致的血管功能不良是AS形成的原因之一。

已有研究报道，运动能有效地调节NO合成及NOS表达，运动可明显升高NO水平，促进血管壁NOS表达，并增强NOS的活性[3]。Hambreoht等研究发现，慢性心脏病患者进行6个月体育锻炼后，使内皮NO生成增加[4]。殷松楼将Wistar大鼠分为对照组和运动组，发现游泳运动组（1．5 h/d，5 d/w，共4周）主动脉NOS活性较对照组明显增强[11]。本研究显示，14周耐力运动干预使ApoE-/-小鼠血中NO和主动脉壁eNOS蛋白表达增加，iNOS蛋白表达降低，并有效地延缓主动脉AS的发生，表明运动对一氧化氮系统的调控作用可能是运动减轻动脉粥样硬化的机制之一。

耐力运动通过改善NO/NOS系统机能而发挥抗AS的作用，可能与以下两个机制有关：其一，在动脉粥样硬化斑块中，大量的iNOS被诱导和激活，高速、持续地产生大量NO，它与过氧化物结合生成一种氧化性更强的过氧亚硝酸盐化合物，可使LDL发生氧化，促进AS的发展。通过耐力运动可以有效地抑制iNOS激活和表达，从而产生较少的过氧亚硝酸盐化合物，使得运动组比模型组iNOS蛋白表达降低，AS病变减轻。其二，耐力运动促进eNOS蛋白表达和提高血中NO水平可能与运动加快血流速度、增加血管壁切应力有关。Shen W等报道，运动时心输出量增加，血液发生重新分配，肌肉及冠状动脉循环的血流量增多，血流加速，使血管壁剪切力增大，促使eNOS催化的NO增多[14]。由此认为，耐力运动通过促进主动脉eNOS蛋白表达、提高血中NO水平和改善血管内皮功能等而发挥抗AS的作用，这可能是独立于血脂调节作用以外的抗动脉粥样硬化机制。

4 结论

（1）14周耐力运动干预使ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积减少、病变减轻，从而延缓了AS的形成。（2）14周耐力运动能有效地增加ApoE-/-小鼠eNOS蛋白表达和提高生物活性形式的NO水平，并抑制iNOS蛋白表达，这可能是独立于血脂调节作用以外的另一抗动脉粥样硬化机制。

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The Effect of Endurance Exercise on Nitric Oxide System in Apoe-Deficient M ice and Its Intervention from A therosclerotisis

ZHANG Hongxia1,2,LIU Shanyun1,LINing1,FENGHong1,WANGHongtao1,WANGMin1,XU Xinnv3,WANG Jinhuan3
（1．Tianjin University of Sport,Tianjin 300381,China;2．Dept．of Clinical Training,Tianjin University of Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3．Key Lab of Emergence Medicine ofMOH,Tianjin First Center Hospital,Tianjin 300192,China）

Objective:The influence of endurance exercise on the function of preventing from atherosclerosis formation and effects of endurance exercise on NO system in ApoE-deficientmicewere investigated to probe possiblemechanisms of anti-atherosclerosis by endurance exercise．Methods:Twenty-four 8-week old ApoE-deficientmice were selected and divided into atherosclerosismodel group and exercise group randomly．There were twelvemice in each group．Mice of exercise group were trained on treadmill for fourteen weeks．Followings were detected:1)the square of atherosclerotic plaque and pathological change;2)the serum NO and the blood lipid;3)the protein expression of thoracic aortic iNOS and eNOS．Results:The square of aorta plaque was significantly smaller in ApoE-deficientmice of exercise group than that in mice of control group(P＜0．01)．The degree of lesion in aorta wall and tunica intima was lighter in ApoE-deficientmice with endurance exercise．The concentration of serum NO and protein expression of aorta eNOS were significantly increased(P＜0．01)in ApoE-deficientmicewith endurance exercise．The protein expression of aorta iNOSwas significantly decreased(P＜0．05)in ApoE-deficientmice with endurance exercise．There was no change on the blood lipid．Conclusions:The present study demonstrated that endurance exercisemay contribute to its anti-atherosclerosis function by significantly increasing eNOS protein expression and blood NO level aswell as inhibiting iNOS protein expression．

endurance exercise;ApoE-deficientmice;atherosclerosis;nitric oxide;nitric oxide synthase

G 804．23

A

1005-0000（2010）02-0122-03

2010-01-06；

2010-03-03；录用日期：2010-03-06

天津市科技计划项目（项目编号：08JCYBJC06000）

张洪侠（1978-），女，安徽宿州人，天津中医药大学助理实验师。通讯作者：刘善云（1958-），女，天津市人，博士，天津体育学院教授。

1.天津体育学院，天津300381；2.天津中医药大学临床实训教学部，天津300193；3.天津市第一中心医院卫生部危重病急救医学重点实验室，天津300192。