LPS诱导流产小鼠蜕膜组织TNF-α及NF-κB的表达

吴 婧， 吴焱森， 赵长瑶 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

LPS诱导流产小鼠蜕膜组织TNF-α及NF-κB的表达

吴 婧， 吴焱森， 赵长瑶 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

目的：比较正常妊娠与脂多糖(LPS)诱导流产小鼠模型蜕膜组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)及核转录因子kppaB(NF-κB)的表达。方法：建立正常妊娠模型和LPS诱导流产模型。采用SABC法测定两组模型孕鼠13d蜕膜组织TNF-α和NF-κB的表达水平。结果：LPS诱导流产模型蜕膜组织TNF-α和NF-κB的表达明显高于正常妊娠模型(Plt;0.01)。结论：NF-κB异常表达可能是小鼠流产的重要因素。

蜕膜组织； 肿瘤坏死因子α(TNF-α)；核转录因子kppaB(NF-κB)；流产；小鼠

近年研究表明,不明原因的自然流产与母体肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)的表达水平升高有关[1,2]，TNF-α能直接引起实验动物的胎盘出血。核转录因子kppaB(NF-κB)是一种快速反应的转录调节因子，几乎存在于所有细胞中，能调控许多趋化因子、粘附因子、生长因子等细胞因子(包括TNF-α)的生成，是基因发挥作用必须通过的基因开关[3，4]。蜕膜组织是母体与胎儿直接接触的界面，蜕膜组织对胎儿的免疫耐受为维持妊娠所必需。本文通过比较正常妊娠与流产小鼠模型蜕膜组织TNF-α和NF-κB的表达水平，旨在探讨二者在流产中的意义与作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 雌性(未经产)、雄性昆明小鼠各20只，10～12周龄，由长江大学实验动物中心提供。

1.1.2试剂与仪器 兔抗鼠NF-κB多克隆抗体、兔抗鼠TNF-α多克隆抗体、即用型链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、枸橼酸盐抗原修复液(0.01mol/L，pH6.0)由武汉博士德公司提供。脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品。切片机(LEICA RM 2135，上海莱卡仪器有限公司)，光学显微镜(Nikon eclipse E800, 日本Nikon)，显微摄像系统(Spot Version3.5, Diagnostic instruments Inc, USA), 图像分析系统(Image-pro plus Version 5.0.2，Media cyberntics Inc, USA)。

1.2方法

1.2.1建立小鼠模型及处理 小鼠常规饲养，自由采食饮水。日光照12h。经适应环境1周后，阴道涂片法进行发情鉴定。发情母鼠与公鼠1∶1合笼过夜，次日清晨检出阴栓者定为孕0d。将受孕雌性小鼠随机分为流产组和正常妊娠组，每组10只。流产组母鼠在孕7d尾静脉注入LPS 0.1μg(0.2ml)。正常妊娠组母鼠注入磷酸缓冲液(PBS)0.2ml。于妊娠第13天处死孕鼠，取胎盘计算胚胎吸收率(R)以评价模型建立成功与否。R=[Re/(Re+F)]×100%，Re为吸收胚胎数,F为存活胚胎数。吸收的胚胎个体小，颜色紫黑，出血坏死，有的已溶化为血团块；解剖镜下观察模糊一片，没有胎膜结构。存活胚胎个体较大，粉红色；镜下观察胎膜及胎儿轮廓清晰，透光度好，无出血，淤血现象。

1.2.2标本处理 在孕第13天处死两组模型鼠，采集蜕膜组织(采集的组织均来自于吸收胚胎邻近的正常存活胚胎)。将蜕膜组织用生理盐水漂洗去掉血液后，用10 %中性甲醛固定24h，石蜡包埋,连续切片，每张厚约5μm。置60℃烤箱，72h烘干后备用。

1.2.3免疫组化SABC染色与观察 按常规程序操作，TNF-α和NF-κB一抗工作液的浓度分别为1∶100和1∶100, DAB为显色剂。用已知的TNF-α阳性SLCa切片和NF-κB阳性切片作阳性对照，用PBS代一抗作为阴性对照。结果判定：细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。按阳性细胞所占的百分比分为4级：阴性(-)表现为不着色；弱阳性()表现为浅黄色；中度阳性()表现为深黄色；强阳性()表现为棕黄色。

1.3统计学处理采用SPSS13.0系统软件包，计数资料组间比较采用χ2检验。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组孕鼠的胚胎吸收率比较LPS诱导流产模型孕鼠的胚胎吸收率明显高于正常妊娠模型，两组比较差异有统计学意义(Plt;0.01)。见表1。

表1 两组孕鼠胚胎吸收率比较

注：两组间比较，*Plt;0.01。

2.2TNF-α的表达状况TNF-α主要表达于正常子宫内膜、流产子宫内膜的腺上皮细胞胞浆和胞膜。从表2可以看出，流产小鼠子宫内膜比正常妊娠小鼠子宫内膜的TNF-α显著升高。

2.3NF-κB的表达状况NF-κB主要表达于正常子宫内膜(见第92页彩色图版Ⅵ之图1)、流产子宫内膜(见第92页彩色图版Ⅵ之图2)的蜕膜细胞胞浆，少数胞核中也有表达，在内膜的血管内皮细胞中亦有表达。从表3可以看出，流产小鼠子宫内膜比正常妊娠小鼠子宫内膜的NF-κB显著升高。

图1 NF-κB在正常小鼠子宫内膜的表达 图2 NF-κB在流产小鼠子宫内膜的表达

表2 两组母鼠子宫内膜TNF-α的表达状况 只

注：两组间比较，*Plt;0.01。

表3 两组母鼠子宫内膜NF-κB的表达 只

注：两组间比较，*Plt;0.01。

3 讨 论

3.1TNF-α与流产的关系国外学者发现，流产率高的孕鼠胎盘中TNF-α表达显著高于对照组，在蜕膜中有过量的TNF-α表达，且当母胎界面TNF-α表达下降时孕鼠流产率也随之下降[5，6]。妊娠期适量的TNF-α能促进妇女能量代谢及胚胎发育，提高孕激素及绒毛膜促性腺激素的合成，并刺激细胞滋养层生成尿激酶型血浆素原激活剂(uPA)，有利于蜕膜细胞外基质降解及胎盘植入，对妊娠维持有重要作用[7，8]。当母体免疫功能异常或某些因素使巨噬细胞等被激活，均可造成TNF-α水平升高，高浓度的TNF-α可能通过多种途径导致流产：激发Th1型免疫反应，排斥胚胎组织；促进滋养细胞凋亡；提高前列腺素E2的合成，兴奋子宫平滑肌引起宫缩；上调促凝血酶原激酶12(Fg12)表达，导致胎盘滋养层血管血栓形成，最终影响绒毛正常发育，出现绒毛滋养细胞(尤其是合体滋养细胞)凋亡增加，直接破坏胎盘屏障的完整性及功能，导致流产的发生[7，8]。本文结果显示，LPS诱导流产模型组孕鼠(胚胎吸收率25.81% )蜕膜组织TNF-α表达明显高于正常妊娠模型组(胚胎吸收率8.75% )(Plt;0. 01)，这与国外的研究结果相符。

3.2NF-κB与流产的关系核转录因子kppaB是一种广泛存在的多效性的核转录因子，为Rel蛋白家族成员，由多肽P50和P65亚基形成同源或异源性二聚体。在静息细胞中，NF-κB主要位于细胞浆，与具有抑制作用的IкB家族结合，其锚蛋白重复序列掩盖了NF-κB的DNA结合位点而干扰NF-κB的功能。可被多种刺激因子如脂多糖、TNF-a、IL-l、病毒、自由基及紫外线等激活，调节趋化因子、生长因子、粘附分子、免疫受体、应激相关酶及急性期蛋白等[9-11]的功能。通过调控靶基因表达产物，NF-κB信号通道参与了感染、炎症、免疫反应、细胞凋亡和肿瘤等病程及细胞周期调控与细胞分化等[12，13]。研究表明NF-κB在多种炎症疾病中均存在着活化现象[14]，调控众多炎症性细胞因子mRNA的表达[15]。NF-κB在激活后可使IL-l、TNF- mRNA的水平上调，而IL-l、TNF-a与流产的关系密切。本文结果显示，LPS诱导流产模型组孕鼠蜕膜组织NF-κB表达明显高于正常妊娠模型组(Plt;0. 01)，表明NF-κB参与了流产过程。可能是NF-κB引起炎性细胞增加，胎盘滋养细胞异常凋亡增加，子宫螺旋小动脉急性粥样硬化，胎盘出血、坏死增加等一系列病理反应，最终导致流产；NF-κB亦可通过增加TNF-a的表达而导致流产。有临床研究证实，NF-κB在早期流产患者的绒毛组织中表达也增高[16]。

综上所述，TNF-α及NF-κB参与了流产过程，但TNF-α及NF-κB对生殖过程各个环节的调节机理尚有待于进一步研究。

[1]Clar DA，Justin M，Lydia L，atal.Ecology of danger-dependentcytokine-boosted spontaneous abortion in the CBA×DBA/2 mouse model[J].Am J Reprod Immunol，2004,52(6):370-378.

[2]Toder V，Fein A，Carp H，atal.TNF-αin prognancy loss and embryo maldevelopment:a mediator of detrimental stimuli or a protector of the fetoplacental unit[J]. Assisted Reproduction and Genetics，2003,20(2):73-81.

[3]Bours V，Dejardin E. The NF-kappaB transeription factor and cancer .High expression of NF-kappaB AND 1kappaB elated proteins in tumor cell lines[J]. BioehEm Phamcol，1994，47(1):145-152.

[4]Huang S，Pettaway CA，Uehara H，atal.Bloekadeof NF.kappaB activeity inhuman prostate cancer cells is associated with suppression of angiogenesis invasion and inetastasis[J].2001，20(31):4188-4196.

[5]Torchinsky A， Markert UR， Toder V. TNF-alpha-mediated stress-induced early pregnancy loss: a possible role of leukemia inhibitory factor[J]. Chem ImmunolAllergy，2005，89(8): 62-71.

[6]Berman J， Girardi G， Salmon G. TNF-alpha is a critical effector and a target for therapy in antiphospholipid antibody- induced pregnancyloss[J]. J Immunol，2005，174(1): 485-490.

[7]Idriss HT， Naismith JH. TNF-alpha and the TNF receptor superfamily: structure - function relationship[J]. Int Gynecol Obstet，2005，88(1): 44-48.

[8]Monz BO，Vadillo OR. Modulation of trophoblast function by tumor necrosis factor-alpha: A role in pregnancy establishment andmaintenance [J]. Am J Obstet Gynecol，2002，187(6): 1574-1580.

[9]Grumont RJ，Gerondakis S. Rel induces interferon regulatory factor-4(IRF-4)Expression in lymphocytes: modulation of interferon-regulated gene expression by Rel/nuclear factor kappaB[J]. ExpMed，2000，1919(8):1281-1292.

[10] Chen F，Castranova V，Shi X，atal.New insights into the role of nuclear factor-kB， a ubiquitous transcription factor in the initiation of disease[J]. Clin Chem，1999，45(1):1-17.

[11]Raffi G，Raelene G，Mathis G，atal.Rel/NF-κ Btranscription factors:key Mediators of B-cell activation[J]. Immunol Rev，2000，176(1)：134-140.

[12] Karin M， Cao Y， Greten FR，atal.NF-kappaB in cancer :from innocent by Stander to major culprit[J].Nat Rev，2002，Cancer:301-310.

[13]Yainamoto Y， Gaynor RB. Therapeutie Potential ofinhibition of the NF-kappaB pathway in the treatment of inflammation and cancer[J]. Clin Invest，2001，107:135-142.

[14]Rangan GK，Wang Y， Tay YC，atal.Inhibition of nuelear factor-кB activetion reduces cortical tobuloinierstitial injury in ProteinurieratsJ[J]. Kidney Intemational，1999，56(1):118-134.

[15] Laiul SM， Tuckennan EM， Cork BA，atal.ExPression of nuclear factor kappaB in human endometrium:rolein the control of interleukin 6 and leukemia inhibitory factor[J].Production Hum Rprod，2000，6(1)：34-40.

[16]吕丽贤.核因子-κB在早期流产患者绒毛组织中的表达[J].医学动物防治，2007，23(6)：476-477.

[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.007

R392.11；R364.7

A

1673-1409(2009)04-R016-03

2009-07-31

吴婧(1980-)，女，湖北监利人，讲师，硕士，从事组织学与胚胎学教学与研究工作。