胶原蛋白的提纯及体外聚合胶原纤维的三维特征分析

向光盛，余 露，陈 蓉 (长江大学医学院, 湖北 荆州 434023)

胶原蛋白的提纯及体外聚合胶原纤维的三维特征分析

向光盛，余 露，陈 蓉 (长江大学医学院, 湖北 荆州 434023)

目的：探索一个简要的胶原提纯方法，比较提取不同来源的胶原蛋白的物理化学特性，利用影像法探讨胶原纤维体外生长聚合三维构建过程和特征，为生物医学工程的生物材料设计和组织工程替代治疗提供基础。方法：利用乙酸法和酶的降解法提取猪脚关节韧带、大鼠尾的胶原蛋白，用光学显微镜定量化分析纤维聚集动力学以及结构特性，包括纤维密度、方向性融合。结果：组织和细胞中Ⅰ型胶原蛋白单分子是120kD，Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)以及α2链表达在120、116kD，Ⅰ型胶原蛋白基质行成的胶原纤维状。结论：应用该修饰方法可提出并纯化到纯的胶原蛋白。第一次报道胶原基质成分在体外可形成三维结构并用黑白视野观察纤维形成特征；阳离子钾、钠、温度及pH影响纤维的强度和胶原的集结时间。

胶原蛋白；胶原纤维；聚合

下一代组织和器官恢复材料的发展需要较好的了解细胞外基质。细胞外基质是天然生物多聚物大分子的集合，包括胶原、粘多糖、蛋白聚糖以及糖蛋白[1]。有几种细胞外基质成分可形成三维结构(支架结构)。在体外这种超分子基质形成通过自我定向聚合作用“自我装配”[2]。胶原是细胞外基质主要结构成份，Ⅰ型胶原分子通常由α1链和α2链组成，多细胞动物的进化过程和发育依赖于这种蛋白能够自我集合成很长多聚体，最长和最丰富是Ⅰ型胶原含有D-型周期纤维，这种纤维出现在细胞外基质像肌腱和韧带，Ⅰ型胶原是三螺旋结构蛋白，具有自我集合成纤维状，这种纤维长度可达数百微米长，更甚者达数厘米长。胶原可从组织中提取，纯化并在体外再重构建产生D-周期纤维。同样，体外形成的纤维也可在有N-端和C-端蛋白酶存在下分解成前体胶原。然而由于体内集合过程更复杂，并产生方向一致很长的胶原纤维，详尽懂得这一形成的分子机理仍相当困难。我们第一次用黑白显微镜观察个别胶原纤维在体外的生长，监测纤维产生的改变，直接研究胶原纤维形成及影响多聚体过程分子机理。

1 材料与方法

1.1材料大鼠尾、猪脚的关节韧带，乙酸，聚丙酰胺凝胶，蛋白胶原酶悬，考馬斯兰。

1.2方法

1.2.1Ⅰ型胶原蛋白的分离与纯化 通过用Chandrakasa,Torchia and piez(1976)的方法并作适当修改[3，4]，将韧带纤维分离，准备提取可溶胶原。简单地将腱和韧带从大鼠尾的肌层下解剖剥离，切成小块，去除蛋白聚糖，离心，然后将小块组织再放入Tris-Hc1缓冲溶液中，4℃搅拌过夜，这一过程导致组织分散，这种分散像溶液中含有自然胶原，胶原纤维片段悬液离心40min以上(10 000g)，收集悬液；剩余组织再在20倍体积的0.5M乙酸过夜搅拌，在10 000g再离心40min收集悬液；两次悬液再加3%氯化钠沉淀，离心，放入0.1M乙酸含有胃蛋白酶的溶液中搅拌过夜，上清悬液含有胃蛋白酶化的胶原，加3%Na2HPO4停止酶的反应，并在1mM乙酸中透析，透析后的粘稠液体通过超速离心，胶原蛋白以液体方式存-20℃保存(或冷冻干燥成固体)。纯化的胶原蛋白在6% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳下通过测定其分子量表达并证明其纯化的纯度。

1.2.2胶原纤维形成过程 胶原在体外诱导生长聚集成纤维，利用已分离纯化的胶原溶解到乙酸并旋转2～3h，加适当阳离子调pH至7，滴少许在载玻片上放30～37℃培养，并在不同时间在显微镜下观察其生长状态。有条件可用聚焦控温显微镜下连续观察，并自动记录其生长自我聚集过程。

2 结 果

图1 6% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示了提取纯化的胶原蛋白表达特征；显示了Ⅰ型胶原蛋白的α1链和α2链表达。栏1代表鼠尾胶原蛋白，栏2和3代表猪韧带胶原蛋白，拦4和5代表猪皮胶原蛋白，栏6购买商品牛皮Ⅰ型胶原蛋白参考对照。

2.1证明胶原蛋白提取的方法的可行性和胶原蛋白的纯度为了证明提取的胶原蛋白的方法的可行性，将纯化的胶原蛋白在6% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考馬斯兰染色，我们的结果显示，Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)以及α2链表达在120、116kD，α链二聚体及三聚体在220、270kD，模糊60kD可能代表蛋白聚糖。为了探查其敏感性，我们用胶原酶消化Ⅰ型蛋白胶原，当用胶原酶消化后，所有带都消失，证明分离纯化的产品全是胶原蛋白(见图1)。为了探查胶原蛋白在组织结构中的分布的组织差异性，我们选择三种组织(大鼠尾、猪脚的关节韧带及猪皮)分别提纯比较，组织和细胞中Ⅰ型胶原蛋白单分子是120kD。

2.2胶原基质纤维自我聚合及再构建的三维特征和显微镜量化分析我们用光学显微镜量化纤维聚集动力学以及结构特性，包括纤维密度、方向性融合。结果中可以观察至胶原纤维融合形成单极或双极顶端融合(见第89页彩色图版Ⅱ之图2A箭头)。纤维形成像绳索或捆绑(见第89页彩色图版Ⅱ之图2 B、C)。黑白视野显微镜观察到了胶原基质纤维自我聚合的再构建的三维特征(见第89页彩色图版Ⅱ之图3)。我们可观察到胶原纤维成分以及它们的空间分布。

图2 光学显微镜(Axiosko 2 )证明I型胶原蛋白基质行成的胶原纤维差异。 纤维形成像绳索或捆绑或(A、B、C)以纤维尖对纤维尖融合。

图3 胶原基质纤维自我聚合及再构建的三维特征

3 讨 论

胶原分子是一高度不对称的两性聚电解质，具有很强的溶解反应[5，6]。这些反应是对pH、离子强度、温度以及胶原浓度的反映。这种分子之间的反应是导致聚集的形式，最终可能形成自然胶原纤维。在聚集过程中，目前大多数稳定地可溶性胶原交联成寡单聚体，这种寡单聚体可从父代组织中直接提取，为了探查胶原蛋白在组织结构中的分布组织差异性，我们选择三种组织(大鼠尾、猪脚的关节韧带及猪皮)分别提纯比较，组织和细胞中Ⅰ型胶原蛋白单分子是120kD，我们的结果显示，Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)以及α2链表达在120及116kD，α链二聚体及三聚体在220和270kD，模糊60kD可能代表蛋白聚糖。为了探查其敏感性，我们用胶原酶消化Ⅰ型蛋白胶原，当用胶原酶消化后，所有带都消失，证明分离纯化的产品全是胶原蛋白。

用光学显微镜量化纤维聚集动力学以及结构特性，包括纤维密度、方向性融合。结果中可以观察至纤维融合形成单极或双极顶端融合。综合分析，这些技术证明了纤维融合的差异性、三维结构及集合特性。之前用扫描电子显微镜观察到的结构也可在体外聚合，证明其是依赖的基质成份[7]。这种体外的聚合随胶原浓度的增加纤维密度增加。但我们不能测量其纤维的直径和强度。

我们利用乙酸法和酶的降解法提取的胶原蛋白，通过聚乙酰胺凝胶电泳揭示了其分子量及纯度，结果显示其分子量约120kD并评估Ⅰ型和Ⅱ胶原蛋白的比率，利用黑白视野显微镜，监测了胶原纤维生长，形状及聚合过程，阳离子钾、钠、温度及pH影响纤维的强度和胶原的集结时间。下一步我们将在有条件的情况下，应用聚焦显微镜研究其三维结构与细胞间的反应，为生物组织工程奠定基础。

[1]Christianasen DL，Huang EK，Silver FH. Assembly of type I collagen: fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties[J]. Matrix Biol，2000，19：409-420.

[2]White JF，Werkmeister JA，Darby IA，etal.Collagen Fibril Formation in a Wound Healing Model[J]. J Structural Biol，2002，137：23-30.

[3]Chandrakasan G，Torchia DA，Piez KA. Preparation of Intact Monomeric Collagen from Rat Tail Tendon and Skin And the Structure of the Nonhelic Ends in Solution[J]. J Biol Chem，1976，251：6062-6067.

[4]Semal P. Collagen Extraction from Recent and Fossil Bones: Quantitative and Qualitative Aspects[J]. J Arch Sci，1995，22：463-467.

[5]Pogany G，Hernandez DJ，Volgel KG. The in Vitro interaction of Proteoglycans with Type I Collagen Is Modulated by Phosphate[J]. Arch Biochem Biophy，1994， 313：102-111.

[6]McBride Jr DJ，Choe V，Shapiro JR，etal. Altered Collagen Structure in Mouse Tail Tendon Lacking the α2(I) Chain[J]. J Mol Biol，1997， 270：275-284.

[7]Trotter JA，KAdler KE，Holmes DF. Echinoderm Collagen Fibrils Growth by Surface-Nucleation-and-Propagation for Both Centers and Ends[J]. J Mol Biol，2000，300：531-540.

[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.003

R33

A

1673-1409(2009)04-R006-02

2009-11-20

向光盛(1957-)，男，湖北荆州人，教授，从事生物化学和分子生物学的教学与研究工作。