4个罗非鱼群体遗传多样性的RAPD分析

王成武，李 娴，杨 玲，客 涵，张志山，杨德光，张延华

山东省淡水水产研究所，山东 济南 250117

张怀菊 (齐鲁动物保健品厂， 山东 济南 250100)

付佩胜 (山东省淡水水产研究所，山东 济南 250117)

4个罗非鱼群体遗传多样性的RAPD分析

王成武，李 娴，杨 玲，客 涵，张志山，杨德光，张延华

山东省淡水水产研究所，山东 济南 250117

张怀菊 (齐鲁动物保健品厂， 山东 济南 250100)

付佩胜 (山东省淡水水产研究所，山东 济南 250117)

采用50个随机引物对奥利亚罗非鱼 (Oreochromisaureus)和3个尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)群体即无锡品系、埃及品系和吉富品系进行RAPD分析，共筛选出13个重复性好的引物，其中引物S1255扩增的2 500 bp片段具有群体特异性，可作为区分奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的分子标记；用PopGen1.32软件进行遗传多样性分析，结果表明：奥利亚罗非鱼、无锡品系、埃及品系和吉富品系罗非鱼群体内的多态位点率分别为22.03%、52.54%、58.47%、62.71%,基因多样性指数分别为0.091 2、0.216 6、0.244 8、0.270 5,Shannon信息指数分别为0.132 3、0.313 6、0.353 7、0.388 1。无锡品系、埃及品系和吉富品系罗非鱼群体内遗传相似性指数分别为0.819 4、0.788 6和0.770 4，遗传变异水平较高，遗传多样性丰富。奥利亚罗非鱼的群体内遗传相似性指数为0.927 9，群体的遗传纯度高，遗传变异水平较低。无锡、埃及、吉富品系尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼之间的遗传距离分别为0.137 0、0.223 5，0.198 6,说明奥利亚罗非鱼和埃及品系尼罗罗非鱼杂交可能产生更强的杂种优势。

奥利亚罗非鱼(Oreochromisaureus) ；尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus) ；RAPD；分子标记；遗传多样性

RAPD技术是1990年由Williams[1]和Welsh[2]在PCR技术基础上发展起来的一种分子标记技术。RAPD分析通常采用随机合成的10个碱基的寡核苷酸引物，从基因组中随机扩增多态性DNA片段，其基因标记可覆盖整个基因组，短时间内可获得大量的遗传标记，RAPD技术在亲缘关系分析、种质鉴定、种质资源保护等方面[3～7]得到广泛应用。

罗非鱼属鲈形目(Perciformes)丽鱼科(Cichidae)罗非鱼属，为温水性鱼类，是联合国粮农组织向全球推广的淡水经济鱼类，因其具有生长速度快、繁殖力强、抗病力强、食性杂等优点，养殖面积遍布多个国家和地区。罗非鱼养殖在我国淡水养殖业中占有非常重要的地位，我国罗非鱼产量占世界罗非鱼年产量的70%。但由于罗非鱼存在性成熟早、繁殖周期短和容易发生种间杂交导致种质退化和混杂等问题，严重影响了其养殖经济效益。为更好地保护和利用罗非鱼资源，笔者采用RAPD技术对奥利亚罗非鱼(Oreochromisaureus)和3个品系(无锡、埃及、吉富)尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)群体进行检测和遗传分析，以揭示不同罗非鱼群体的遗传多样性及种间遗传差异，并了解其种质现状，为罗非鱼良种培育和选育提供理论依据，并为分子标记辅助育种工作提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

试验所用奥利亚罗非鱼和3个品系尼罗罗非鱼均取自山东省淡水水产研究所罗非鱼原种场，每种各取5尾进行RAPD分析。其中奥利亚罗非鱼(A)由山东省罗非鱼原种场引自埃及；无锡品系(W)中国水科院淡水渔业研究中心1992年引自美国；埃及品系(E)山东省罗非鱼原种场2000年引自埃及；吉富品系(G)由山东省淡水水产研究所罗非鱼原种场引自海南。

试验所用随机引物均购自上海生工生物工程公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、Marker等试剂为大连宝生物工程有限公司生产；PCR仪为Takara TP650型。

1.2 方法

(1) 总DNA提取 每尾鱼取背部肌肉300 mg，充分剪碎后于研钵中加液氮研磨成粉末，加入2 mL细胞裂解液(Tris-Cl 50 mmol/L pH 8.0、EDTA 100 mmol/L pH 8.0、0.5% SDS )，加入终浓度0.1 mg/mL的蛋白酶K，充分混匀后放入37 ℃水浴中消化12 h。加入等体积 Tris饱和酚抽提2次，再加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提至无蛋白质中间相，加入2倍体积的无水乙醇沉淀后，70%乙醇洗涤2次，加入TE(pH 8.0)充分溶解后置于-20 ℃保存。

(2) PCR扩增 PCR反应体系总体积为25 μL，其中：10 ×buffer 2.5 μL,dNTPS2 μL(各2.5 mmol/L),MgCl23 μL (25 mmol/L),随机引物2.5 μL (2μmol/L),Taq DNA聚合酶0.25 μL( 5U/μL)，模板DNA 1 μL,以灭菌双蒸水补齐。

PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min后进行45个循环：94 ℃变性 40 s ，36 ℃退火 50 s ，72 ℃延伸 90 s；最后于72 ℃延伸10 min。

取2 μL PCR产物,加入适量loading Buffer,在1.4%的琼脂糖凝胶上按5 V/cm凝胶电压下进行电泳分析，EB染色，置于凝胶成像系统下观察并拍照。

(3) RAPD引物筛选 以奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼DNA为模板，采用50个引物进行RAPD引物筛选，挑选出重复性好的带型清晰的引物用于进一步试验分析。

1.3 数据处理

统计在琼脂糖凝胶上出现的DNA片段，同一电泳凝胶上，迁移率相同的都视为同一位点，无论强度明亮与否，只要清晰可见的都采用，按出现的记为“1”，不出现的记为“0”，进行统计，将电泳图转化为0，1矩阵。把每一条带看做一个等位基因，假设实验群体处于Hardy-Weinberg平衡，用PopGen 1.32软件计算各群体的多态位点率、Shannon信息指数和基因多样性指数,其计算方法分别为：

多态位点比例(P，%)=多态位点数/位点总数×100

个体间的遗传相似系数参照Lynch[8]的公式计算

Sxy=2Nxy/(Nx+Ny)

式中,Nxy是个体x和y的共有条带数；Nx和Ny分别是个体x和y的扩增条带数。

群体内的遗传相似性系数(S)为群体内所有两个个体间相似系数的平均值。群体间的遗传相似性指数(Sij)是群体i和群体j中的任意两个个体随机组合得到的相似系数的平均值，群体间的遗传距离Dij用下式计算[9]：

式中,Si和Sj是种群i和j的群体内遗传相似指数。

基于遗传距离D，采用UPGMA(Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Average)方法对4个罗非鱼群体进行聚类分析。

Shannon信息指数I=-∑XilnXi(Xi为位群体中位点i的显性频率)

基因多样性指数H=1-∑Pi2(Pi为群体中位点i的显性频率)

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

从本研究所用的50个引物中进行筛选，共筛选出重复性好的引物13个：S1038、S1255、S2016、S509、S1104、S419、S1024、S1199、S448、S307、S1307、S1064、S1305。13个引物都产生了具有个体或群体特异性的条带，共扩增出118条带，平均每个引物扩增出9条带，扩增出的片段分子量在300～3 000 bp之间，筛选出的引物名称和序列见表1。

表1 随机引物编号及其序列Table 1 Random primers and their sequences

2.2 4个罗非鱼群体的遗传多样性

经PopGen 1.32软件计算，奥利亚罗非鱼、无锡品系、埃及品系、吉富品系尼罗罗非鱼的多态位点数分别为26、62、69、74，多态位点率分别为22.03%、52.54%、58.47%、62.71%，基因多样性指数分别为0.091 2、0.216 6、0.244 8、0.270 5，Shannon信息指数分别为0.132 3、0.313 6、0.353 7、0.388 1。与奥利亚罗非鱼相比，3个尼罗罗非鱼群体的遗传多样性均较丰富，其中吉富品系在3个品系尼罗罗非鱼中遗传多样性最为丰富。

2.3 4个罗非鱼群体的遗传相似度和遗传距离

表2 4个罗非鱼群体的群体内和群体间的遗传相似系数和遗传距离Table 2 Intra-and interpopulation genetic similarity coefficients andinterpopulation genetic distances in four tilapia populations

注：数字矩阵对角线以上数字为群体间遗传相似系数，对角线以下为群体间的遗传距离,对角线上数字为群体内遗传相似系数。

依据13个引物的扩增结果计算出奥利亚罗非鱼、无锡品系尼罗罗非鱼、埃及品系尼罗罗非鱼和吉富品系罗非鱼群体内和群体间的遗传相似度和遗传距离(表2)。结果显示，4个罗非鱼群体的群体内遗传相似系数为：A(0.927 9)、W (0.819 4)、E (0.788 6)、G (0.770 4)；其中奥利亚罗非鱼的群体内相似系数最大，说明其群体内的遗传变异性很小，而3个品系尼罗罗非鱼群体内的遗传相似系数较小，说明其群体内的遗传变异程度较大。4个罗非鱼群体的群体间遗传相似系数在0.684 1～0.741 8之间，其中无锡品系和埃及品系的遗传相似系数最大，为0.741 8(D=0.080 3)，埃及品系和奥利亚罗非鱼群体间的遗传相似系数最小，为0.684 1(D=0.223 5)。无锡品系、埃及品系和吉富罗非鱼群体与奥利亚罗非鱼群体间的遗传距离分别为0.137 0、0.223 5和0.198 6(表2)。

2.4 种间特异性标记

采用引物S1255进行扩增，结果显示，奥利亚罗非鱼在2 500 bp处有一特异扩增性片段，在其他3个尼罗罗非鱼群体中均未出现(图1)，且该片段具有很好的重复性，可作为区分奥利亚罗非鱼与其他3个品系罗非鱼的分子标记。

1～5: G ； 6～10: E ； 11～15: W ； 16～20: A ； M：DNA Marker Ⅲ。箭头所指为特异带。图1 引物S1255对4个罗非鱼群体的扩增结果Figure 1 The RAPD results amplified by primer S1255

图2 用类平均聚类法构建的4个罗非鱼群体的聚类图Figure 2 UPGMA dendrogram on the basis of genetic distance

2.5 聚类分析

根据遗传距离,用MEGA4软件的

UPGMA程序对4个罗非鱼群体进行聚类分析，其结果见图2。由图2可见，无锡品系和埃及品系尼罗罗非鱼首先聚在一起，其次是吉富品系罗非鱼，最后是奥利亚罗非鱼。

3 讨论

3.1 罗非鱼的分子标记

很多学者对罗非鱼的分子遗传标记方面进行了研究，曹萤等[10]利用mtDNA酶切技术发现PvuⅡ酶在奥利亚和尼罗罗非鱼上酶切结果不同，可作为区分2种罗非鱼的分子标记；王文君[11]研究发现内切酶ApaⅠ可区分奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼；夏德全[6]研究发现4个引物的扩增片段可作为鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的分子标记，但未找到鉴别3个尼罗罗非鱼群体的分子标记；杜诚等[5]对5个罗非鱼群体进行的遗传分析和分子标记研究中发现引物S509扩增的片段可作为区分奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的分子标记，同时还发现AnⅠ、AnⅡ、GF区分AnⅢ的分子标记，AnⅡ区分AnⅠ、GF的分子标记；赵金良等[12]研究发现Est-2谱带为埃及品系和吉富品系罗非鱼特有，可作为与其他品系尼罗罗非鱼区分的生化遗传标志。

本研究中发现引物S1255在2 500 bp的扩增片段为奥利亚罗非鱼所特有，而在其他3个尼罗罗非鱼群体中均未出现，可作为区分奥利亚罗非鱼与其他3个尼罗罗非鱼群体的分子标记,由于3个尼罗罗非鱼群体间的遗传相似系数较高(群体间遗传相似度为0.693 8 ～ 0.741 8)，未找到有效鉴别它们的分子标记。

3.2 4个罗非鱼群体的遗传多样性

本研究通过RAPD方法分析了4个罗非鱼群体的遗传多样性和遗传变异水平。其中奥利亚罗非鱼的多态位点率、基因多样性指数和Shannon信息指数分别为22.03%、0.091 2和0.132 3，其群内遗传相似指数高达0.927 9，说明奥利亚罗非鱼群体的遗传变异较小，这与夏德全[6]、杜诚[5]和董在杰等[13]的研究结果相似。造成这种结果主要是因为奥利亚品质罗非鱼群体在引进时经历了遗传瓶颈效应影响，并且由于奠基群小，在纯种繁殖时存在群体内的近交，从而形成高遗传纯度的群体。高遗传纯度使通过家系选育提高奥利亚罗非鱼的性能很难进行。可见在今后奥利亚罗非鱼的育种工作中，应防止近交衰退，在确保选育亲本数量的同时还应加强对选育群体遗传多样性的检测，在保持优良性状稳定性的同时，最大限度地保留其遗传多样性水平。

吉富品系罗非鱼是国际水生生物资源管理中心利用4个亚洲尼罗罗非鱼品系(以色列、新加坡、泰国、中国台湾)与4个非洲尼罗罗非鱼品系(埃及、加纳、肯尼迪、塞内加尔)进行种内杂交选育而成的，其遗传背景复杂，杂种优势相当明显，生长速度快。本研究结果表明，与奥利亚罗非鱼相比，3个尼罗罗非鱼群体都具有较高的遗传多样性水平，遗传变异较大，其中吉富品系罗非鱼遗传多样性水平最高，遗传纯度低。

为解决罗非鱼性成熟早导致的过度繁殖影响养成的现象,目前生产中主要采用奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交生产高雄性率的尼奥鱼，同时充分利用其杂种优势达到提高罗非鱼生长速度和产量的目的，王楚松等[14]研究报道，尼罗罗非鱼鱼奥利亚罗非鱼的杂交子代雄性率可达95%。无锡品系、埃及品系和吉富品系尼罗罗非鱼群体与奥利亚罗非鱼群体间的遗传距离分别为0.137 0、0.223 5、0.198 6，这一结果与其他学者[5，6，15，16]对奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼种间遗传差异的研究结果基本相同，说明用RAPD技术对罗非鱼的遗传多样性检测可信度较高，其中埃及品系尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼群体间的遗传距离最大(0.223 5)。孙其信等[17]和Melchinger等[18]的研究表明，在遗传距离小于0.54的范围内，亲本间的遗传距离越大，其杂交子代基因型杂合度越高，杂种优势越强；据此可以推断，以奥利亚罗非鱼和埃及品系尼罗罗非鱼为亲本进行杂交，其杂交子代的杂种优势会较强。鉴于吉富品系罗非鱼的特殊遗传背景所表现出的杂种优势，吉富与奥利亚杂交子代同样也保持了生长速度上的优势。据报道，“吉奥”鱼的养殖效果是3个尼罗与奥利亚罗非鱼杂交组合中最好的，但雄性率稍低[19]。杂交子代雄性率的高低与亲本的种质纯度有很大关系，亲本的纯度越高，雄性率越高，因此有效提高罗非鱼亲本纯度是提高雄性率的关键。本研究中的3个尼罗罗非鱼群体遗传多样性均很丰富，需不断进行选育保持其遗传纯度以提供优良的杂交后代。

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2008-08-19

山东省农业良种工程项目

王成武(1979-)，男，山东济南人，农学硕士，助理研究员，主要从事鱼类遗传育种研究.

付佩胜，E-mail:jnsfu@126.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.01.017

Q37;Q959.483

A

1673-1409(2009)01-S059-05