如何做好组织培养生产过程中污染防止工作

祁恒佐

摘要:组织培养的英文为mericlone,是meri(meristem=分裂组织)+ clone (营养繁殖系)的合成语。又称植物克隆,指通过无菌操作把植物体的外植体接种于人工配制的培养基上。在人工控制的环境条件下进行离体培养。而污染是植物组织培养中的三大难题之一,普遍发生于不同的植物组织、器官中,控制污染是组培苗生产中的重要环节。文章就组织培养过程中的污染来源及防止作了些探讨。

关键词:组织培养;生产过程;污染来源

中图分类号:Q943文献标识码:A

文章编号:1674-1145(2009)20-0102-02

随着生物技术的发展,组培生产技术在我国农业生产中应用速度很快,我国组培工业化生产始于20世纪70年代,近年来这项技术的应用范围十分广泛,尤其在作物育种、苗木及花卉的脱毒和快繁等方面更具其他技术手段所无法比拟的优势。虽然组织培养技术操作并不难,但对一些技术环节的要求却十分严格,稍有疏忽便会延误实验进程,甚至导致整个试验失败,为此我们必须重视在组织培养生产过程中污染带来的危害。以下就组织培养过程中的污染来源及防止作一些探讨。

一、在组织培养生产过程中污染的来源

(一)外植体自身带菌

许多植物都是栽培在室外,而空气环境中有大量微生物存在,这些微生物可通过植物自然的孔口或伤口进入植物内部,也有一些兼性腐生菌,可由外植体或通过相应的侵入机制侵入植株内部,如果在接种操作前对这些认识不足,对外植体消毒不严,就很容易发生污染现象。

(二)培养基或接种工具灭菌不彻底

在对培养基灭菌过程中,如果灭菌时间过短、灭菌时温度达不到要求、灭菌锅压力记数不准等因素都有可能导致培养基灭菌不彻底,使一些病原微生物残留在培养基中,一旦接种后就会造成污染。使用灭菌不彻底的接种工具,灭过菌的接种工具存放时间过长,都会导致在生产中造成污染,所以生产中要做好培养基和接种工具的灭菌和消毒工作。

(三)接种室消毒不严

在组培生产过程中,除了植物本身外,大部分污染来源便是来自接种操作室。因为在接种操作室中,未过滤的空气中含有大量的微生物,这些微生物可随着操作人员或植株接触时而发生污染,所以接种室消毒不严,也易引发污染发生。

(四)人员因素

在整个操作室内,人员是最大的带菌者,其不管在毛发或是衣服等,都隐藏着数不清的微生物。这些微生物的存在都可能造成一定的危害。为此在进入操作室前,接种人员的工作服、鞋帽都必须进行消毒处理,进入接种室必须换上消毒过的鞋帽,接种前,接种人员必须认真洗手,还要用70%的乙醇棉球擦拭双手,这样在一定程度上可减轻污染的危害。

(五)超净工作台上的滤网过滤不彻底

超净工作台使用过久,或保养不当,而造成滤网坏掉或灰尘过多,导致在接种操作时对空气过滤不彻底,也易产生污染。

(六)栽培过程污染

在栽培室,组培瓶外和外界气体交换时,亦会有一些微生物进入。污染几率取决于空气中带菌密度与组培瓶空气交换率。

二、防止污染的方法

(一)认真做好外植体的选择和消毒工作,防止外植体带菌

对外植体的选择要考虑选择的时间和部位,尽量选取带菌少的材料,在时间上一般在植株的生长旺盛季节如春季和秋季病原微生物数量相对要少些,对于外植体的部位一般以幼嫩的部位较好。另外要做好外植体的消毒工作,目前外植体消毒常用药剂有:70 %～75%的乙醇溶液,0.3%～0.6%的次氯酸钠溶液和0.1%的升汞溶液,选用何种消毒剂和消毒时间要根据外植体的幼嫩程度和部位确定,一般要求既将外植体表面的微生物杀死,又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。在生产实践中防止外植体污染,也可实行多次灭菌和交替灭菌相结合的办法,最终达到消灭杂菌的目的。

(二)改善接种室和培养室的环境条件,保证接种与培养环境清洁无菌

与外植体自身带菌所产生的污染相比,操作污染和环境污染是可以克服的。在组培生产中,真菌的污染一般与环境有关,细菌污染与接种材料及工具有关。生产中要通过定期做好对接种室与培养室消毒工作,减少环境中的微生物数量,减轻对污染的危害,为此,在接种前接种室要认真做好消毒工作,且超净工作台在接种前,认真擦洗,紫外灯要开20～30min左右。培养室的相对湿度应控制在70%左右,对每件物品放到超净工作台上,都要用75%酒精认真擦洗一遍,方可放到台面上,只有这样在一定程度上可控制污染程度。

(三)操作人员严格遵守无菌操作规程

接种人员在接种操作中,应严格遵守无菌操作规范要求。接种人员的工作服、口罩、帽子等布质品要定期进行湿热灭菌,在超净工作台的操作区内,不要放入过多的待用物品,避免气流被挡住产生污染。定期清洗或更换超净工作台过滤器,接种前15～20min打开风机,风速调整到20～30m/min,并对台面用75%酒精喷雾消毒,工作人员进入操作室前必须对工作服、鞋帽进行消毒处理,进入接种室必须换上消毒过的鞋帽,接种前,接种人员必须认真洗手,还要用70%的乙醇棉球擦拭双手,只有接种过程中严格遵守操作要规范,才可避免因人为(转上页)(接下页)因素造成污染。

(四)培养基及接种工器具要严格灭菌,确保灭菌质量

在对培养基和接种工具灭菌时,要先检查灭菌锅的使用情况,发现问题要立即检修。在灭菌过程中要绝对保证灭菌应达到的压力、时间,确保灭菌质量。一般要求压力应达到0.1个大气压,时间维持在15～20分钟,并且压力表降到零后不能马上出锅,防止外界环境的冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起真菌污染,应待锅内稍冷却后再出锅。对组培生产过程中培养容器封口采用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等材料,在使用前要认真做好清冼和消毒工作,不符合要求坚决不用。在分装培养基时,勿触瓶口,防止培养基粘在瓶口上,引起污染,瓶口封好后要检查封口是否破损,扎瓶口位置适当,松紧适宜。对已污染组培瓶要经高压灭菌后再清洗。

(五)在培养基中加入适量的抗生素

这是目前较常用的方法,抗生素可以直接加入到培养基中,也可以用抗生素喷洒或浸泡外植体。但植物种类不同,所用抗生素的种类、浓度和处理时间也不同,因此必须对不同植物采用不同的抗生素的种类、浓度和处理时间进行实验探讨。一般情况下,为消除革蓝氏阳性菌对有些木本植物污染茎段组培苗,可在培养基中加入四环素、头孢等混合物,可使细菌完全被消除。另外用头孢菌素Ⅱ消除某些观赏植物外植体中的内生菌也有非常明显的效果。

(六)利用病毒在植株体内分布不均匀的原理,生产脱毒苗

主要是针对在植物内部寄生的病毒,因病毒在生长点区域几乎不存在,且病毒也难以长到顶芽的分生组织,所以切取顶芽的分生组织进行组织培养,通过组织培养技术就可培养成无病毒植株,而且脱毒效果好,后代遗传性稳定,所以是目前生产无病毒苗最安全、最重要的一条途径。

(七)利用培养基中高盐或高糖的浓度,抑制微生物的生长

在培养基中有一些高盐或高糖的浓度可抑制微生物生长,或单宁酸存在时也可以达到抑制微生物生长的效果。

(八)减少培养基中的某些有机成分,可抑制微生物的生长繁殖

培养基中有机物如VB1、VB6、烟酸等有机成分,是某些细菌生长的必需物质,除去这些有机物后,细菌无法生长发育,逐渐死亡减少。这样也可在一定程度上减轻污染所带来的危害。

总之,组培生产中污染的发生是不可忽视的环节,在生产过程中思想上要高度重视,行动上要有严格遵守操作规范,才能在一定程度上减轻污染所带来的危害。