人乳头瘤病毒检测技术研究新进展

安 妍 孙秀明 姚 军

人乳头瘤病毒(Human papilloma virus, HPV)属乳多空病毒科乳头瘤病毒属,病毒颗粒直径约为55nm,核壳呈20面体对称,有72个壳粒。HPV是小型DNA肿瘤病毒,无包膜,具双链闭环DNA 基因组,7.2～8kb ,相对分子量为5×106道尔顿。基因组为环状双链DNA 分子,含近8,000个碱基对(bp)。目前为止,已鉴定出100余种类型HPV,依致病性不同,可将其分为高危和低危两大类别,前者包括与宫颈癌密切相关的HPV16、18、31等型别, 后者包括HPV6、11、34等引起尖锐湿虎等良性病变的型别[1]。

1 HPV 检测方法

1.1 细胞病理学检测 在宫颈移行区取材,巴氏染色可见由HPV引起的挖空细胞,即可诊断。但由于巴氏涂片的取材方法、涂片质量、染色技术与报告方式等诸多因素影响,常造成较高的假阴性率,多用于大规模普查和筛查。近年来,随着标本采集及制片、阅片技术的进步,已由传统的巴氏涂片发展成薄层巴氏涂片(TCT)和涂片自动检测系统[2]。

1.2 阴道镜检查 阴道镜检查法,阴道镜可发现肉眼看不见的亚临床病变,并在可疑病变处定位活检,可以做到早期诊断。但阴道镜的敏感度和特异度均较低,尤其是特异度,不宜作为筛查的方法[3]。

1.3 电镜技术 阴道镜种类包括:传统光学阴道镜、光电一体阴道镜及电子阴道镜。HPV是最早在电镜下观察到的病毒之一,将活检标本负染,若能在电镜下见到特征性的病毒颗粒,即可作出诊断。电镜检查法虽然准确率很高,但费时,需特殊仪器设备,且检出阳性率很低[3]。

1.4 宫颈摄像检查 子宫颈摄像检查是宫颈癌的一种辅助筛查手段,其方法是在宫颈外口涂布5%的醋酸后行静态拍照,然后由有经验的阴道镜医师进行评估。此方法能观察到取材时漏掉的宫颈非典型转化区病变,弥补细胞学涂片假阴性率高的不足,有助于对可疑或核异质涂片的细胞学分类。虽然该方法是筛查宫颈病变的灵敏手段,但特异性较低[3]。

2 血清学检查

随着免疫学研究的不断深入,在血清中也可检测到一些具有参考价值的指标作为宫颈癌诊断治疗检测及随诊中的标志物。HPV感染的血清学检测包括免疫组织化学法、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附法等。免疫组织化学法通过抗L1蛋白抗体与外壳蛋白反应检测HPV。放射免疫沉淀法测定CIN 和宫颈癌患者血清中HPV16 抗体水平。酶联免疫吸附试验(ELISA) 测定针对型特异性L1 类病毒颗粒(VLP) 的IgM 和IgG抗体检测HPV [4]。但HPV病毒不能在体外培养增殖,故血清学检查发展缓慢。另外,多数人感染过HPV后均有可能在血清中出现抗体,并非宫颈癌所特有,所以HPV的血清学检测用于宫颈癌的诊断有待于进一步的研究。

3 分子生物学技术

传统HPV检测方法的特异性和灵敏度均不够理想, 存在较高的假阴性率和假阳性率, 且不便于对HPV进行分型, 因而分子生物学检测技术的出现和日臻完善具有重大意义[5]。

3.1 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术不仅能对HPV进行确诊,而且还能对HPV进行分型。目前,检测的指标主要有: HPVDNA检测、HPVmRNA检测、HPV病毒量。其中,对HPVDNA检测的核酸杂交检测方法的研究和使用较为广泛。利用放射性核素或生物标记的HPVDNA探针来检测患者标本中是否存在互补的核酸链,最常用的方法为斑点杂交法,其次为DNA印迹法及原位杂交[6]。

3.2 聚合酶联反应 以聚合酶链式反应(PCR) 为基础的检测方法是用PCR方法先进行目的基因的扩增,然后再用各种方法进行检测。应用此法可检测HPVDNA,可进行基因分型,还可以应用于检测病毒负荷定量、DNA 测序和突变分析,也可以进行多重扩增,同时分析多个DNA 序列。因其对标本的来源无严格限制,如病变组织、脱落细胞、新鲜标本或保存已久的石蜡切片等均可,目前认为此检测方法是进行HPV DNA检测及分型的最好方法[7]。

4 展望

综合各种HPV检测方法,细胞学检查有效但缺乏敏感度, HPVDNA 检测的灵敏度很高,但其特异性相对低,PCR进行分型时操作比较繁琐、一次检测的样本量有限、限制了其在大规模筛查中的应用。随着分子生物学技术的发展, 核酸分子杂交技术和PCR技术将有广阔的发展前景。进一步提高HPV检测技术的灵敏度和特异度, 增强检测技术的分型能力, 减少财力、人力和物力的消耗,将是HPV检测技术今后的改进方向。

参考文献

[1] Da Silva DM, Eiben GL, and Fausch SC, et al.Cervical cancer vaccines: emerging concepts and developments .J Cell Physiol,2001,186(2):169182.

[2] 姜波玲, 肖长义. 宫颈中人乳头瘤病毒检测的研究进展. 国外医学妇幼保健分册, 2005, 16(6):407410.

[3] 刘翠华, 马文丽, 郑文岭. 人乳头瘤病毒的诊断研究进展. 国外医学妇产科学分册, 2002, 29(4):213216.

[4] 牛淑芳, 吴素慧. 人乳头瘤病毒检测的研究进展. 实用肿瘤学杂志, 2006, 20(2):143145.

[5] Poljak M, Marin U, Seme K, et al. Hybrid capture II HPV test detects at least 15 human papillomavirus genotypes not included in its current highrisk probe cocktail. J clin Virol, 2000, 25(l3):89.

[6] Xu Q, Wang YH, Tong WJ, et al. Interaction and relationship between angiotensin converting enzyme gene and environmental factors predisposing to essential hypertension in Mongolian population of China. Biomed Environ Sci, 2004, 17(2):177186.

[7] Mauricio U, Tatiana G. Two L1peptides are excellent tools for serological detection of HPV associated cervical carcinoma lesions. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 332 (1): 224232.