氨基甲酸酯类农药残留分析研究进展

姚晶晶　袁友明　王明锐　廖　李

摘 要：综述了传统的高效液相色谱、气相色谱分析方法及其相应的样品前处理方法，以及近几年来用于氨基甲酸酯农药测定的新技术如超临界流体提取、超临界流体色谱、气-质联用及一些非色谱技术如免疫检测、生物传感器及电化学检测等。

关键词：氨基甲酸酯；农药残留；分析方法；进展

中图分类号：O69文献标识码：A 文章编号：1005-569X(2009)05-0030-04

1 引 言

氨基甲酸酯类农药(NMCs)是继有机磷之后出现的一类农药，主要有呋喃丹、涕灭威、灭多威、残杀威、叶蝉散、速灭威、西维因等。20世纪70年代以来，由于有机氯农药受到禁用或限用，以及抗有机磷杀虫剂的昆虫品种日益增多，因而NMCs的用量逐年增加，这就使得NMCs的残留情况倍受关注。NMCs的结构特性是含有一个N-甲基基团，为白色晶体，难溶于水，易溶于丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈等，碱性和高温条件下很易被水解。具有杀虫效力强、作用迅速等特点。它的最大优点是在植物中只短暂停留，大多数的NMCs在施用后很短的时间内就可被降解成相应的代谢产物，这些代谢产物通常具有与母体化合物相同或更强的活性。例如，涕灭威亚砜比涕灭威本身具有更有效的抗胆碱酯酶作用。当要监控农药残留的时候，这些在数量上更多于母体NMCs的代谢产物必须考虑在内。其结构为：

目前应用于氨基甲酸酯农药残留检测的方法分为化学法和生物法两大类。氨基甲酸酯类农药的测定化学方法主要有色谱法和分光光度法等。色谱法多采用传统的液-液萃取和柱色谱净化前处理技术，用气相色谱(GC)或高效液相色谱法(PHLC)测定。生物法包括活体生物测定法、乙酰胆碱酯酶抑制法、酶联免疫法和快速酶法等，简单快速，易操作，但检测的物质和农药品种有限。近年来在氨基甲酸类农药残留定量分析方面应用的新技术包括现代光谱分析技术、现代波谱分析技术、波谱和色谱联用技术、免疫分析技术和生物传感器等。

2 样品的前处理

对土壤及植物样品中NMCs残留的分析，传统的方法是溶剂提取附加一些物理方法(如振摇、索氏提取)，然后经过净化除去干扰物，最后进行色谱分析。McGarvey[1]曾对水、土壤和植物样品的检测从提取、净化、回收和灵敏度各方面做了总结。多残留分析中，最常用的提取试剂有丙酮、二氧甲烷、石油醚、乙腈、乙酸乙酯、甲醇等；最常用的净化步骤是液-液分配(LLP)后经过柱层析或固相萃取(SPE)分离。LLP常用的溶剂有二氯甲烷、石油醚、己烷和乙腈，柱层析常用的有Florisil、Celite-Nuchar、硅胶和氧化铝，经常用于NMCs的SPE小柱包括C18和氨基丙基键合硅胶。样品前处理方面的研究主要是样品提取和净化方法的简单化、微型化和自动化，如超临界流体萃取(SFE)、固相萃取(SPE)等。

2.1 液-液分配

对于极性较大的NMCs的分析，采用LLP法净化具有很大的局限性，回收率往往很低。例如，12种不同的食品样品中的25种母体NMCs及其代谢物的研究结果显示，使用LLP法，极性代谢物涕灭威亚砜在大多数样品中的回收率均低于20%～30[2]。而应用SPE净化，回收率可达到90%以上。样品中NMCs的损失主要在LLP一步，是由于极性化合物在有机相中不利的分配系数造成的。

2.2 固相萃取

Holland等用C18柱筛选葡萄酒中74种农药如西维因，方法快速，重现性好。将其与HPLC/(LC)在线结合可实现多种农药残留的全自动分析。

近几年来，对NMCs，及其代谢物的分析逐渐采用SPE小柱取代传统的液-液分配和柱层析法对样品进行净化和浓缩。以下是几种不同的固相小柱的应用情况：①在高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)或气相色谱(GC)分析前，用C18固相小柱对水样或酒样进行前处理；②氨基丙基小柱用于谷物、水果、蔬菜中NMCs残留检测有机干扰物的净化，洗脱剂为1%的甲醇-二氯甲烷溶液，接着换成含有稀盐酸的甲醇溶液，最后进行HPLC分析。当添加水平为20 μg/kg时，NMCs及其代谢产物的回收率为60%～103%。③采用氨基丙基键合硅胶小柱作为净化手段，净化含有21种NMCs及10种代谢物的二氯甲烷提取液。④用免疫亲和柱富集食品样品中的呋喃丹，柱中的抗体可特异性地亲和不同介质中的呋喃丹。采用液相色谱-质谱(LC-MS)，则土豆样品中呋喃丹的最低检测限可达2.5 ng/g。

2.3 超临界流体萃取

SFE具有其独特的特点：①快速方便，具有选择性；②超临界流体黏度小，扩散能力强，传质速度快，最常用CO₂易于制备，基于不同的压力、改良剂，其溶解范围广，无毒，不燃，可以大量使用，③超临界流体密度、溶解度和黏度都能通过压力来控制；④由于相对低的萃取温度，SFE适于热敏化合物；⑤只要通过减压就可达到溶剂与萃取物的分离；⑥SFE可与GC、HPLC、超临界流体色谱(SFC)联用；⑦与液体萃取相比，SFE的样品用量小，溶质溶度低，分析时间短。SFE最早用于高湿样品(湿土、水果、蔬菜)中NMCs分析。对于冰形成及限流器堵塞这样的一般问题，可采用溶剂阱和温和加热限流器来克服。最近Lehotay等报道了用SFE提取水果和蔬菜中涕灭威等氨基甲酸酯农药，采用了控制水含量、用CO₂清洗提取器以去氧、提取前先冷冻样品等措施提取土豆、橘子和桃中包括西维因和呋喃丹在内的大约40种农药，可以得到很高的回收率和重现性，回收率为90%～105%，标准偏差为1%～6%。

还有一种方法是在SFE之前先将样品吸附于固相多孔介质上。Lehotay和Eller在提取植物组织中的西维因、呋喃丹和其它农药时，先将样品吸附于经过十八硅烷基改进的硅胶上，然后在60 ℃，32.4×424×106Pa(320atm)下以SFE提取，以气相色谱-质谱(GC-MS)进行分析。结果葡萄、胡萝卜和土豆样品中的回收率大都超过80%。SFE虽有很多优点，但也有以下的局限性。SFE仅适用于分析物浓度在ng/kg至μg/kg范围，若浓度过高，易导致萃取不完全，且因为同时浓缩了杂质，会干扰检测；SFE用于挥发性化合物，要求严格的技术；若分析物为高极性，就不可能溶于未改进的非极性的CO₂中，需在CO₂中添加甲醇、丙酮等极性改良剂；SFE中，基质与溶质、溶剂的作用对萃取过程产生很大的影响；水的存在通过影响CO₂溶解影响萃取，水包在基质表面上，阻碍CO₂渗透，不利于非极性化合物的萃取。因此，SFE应用于农药残留分析尚处于初期阶段，有待深入研究。

SFE在多项农药残留分析中是一项具有发展前景的样品前处理新技术，可替代溶剂提取方法，但在常规分析中还未得到广泛应用。

2.4 凝胶净化

早在20世纪60年代，瑞典科学家Flodin首先试制成交联葡聚糖，并应用于生物化学研究中一些物质的分离，取得了满意的结果。这种分离方法主要根据溶质(被分离物质)分子量的不同，通过具有分子筛性质的固定相(凝胶)，使物质达到分离。随着适用于非水溶剂分离的凝胶类型的增加，凝胶渗透应用于农药残留净化在近些年来得以发展，如多孔交联聚苯乙烯(商品名Bio-Beads-S-X)可用于分离有机溶剂中脂质聚合物和疏水物质。实际应用表明Bio-Beads-S-X能有效地分离脂质与农药，若流分确定适当，则可以得到令人满意的回收。乙酸乙酯和环己烷(1∶1)、二氯甲烷和环己烷(1∶1)等是凝胶渗透中常用的洗脱剂。

3 化学检测方法

3.1 色谱方法

3.1.1 高效液相色谱法(HPLC)测定

高效液相色谱法(HPLC)的检出限比气相色谱的要高。HPLC对于气相色谱法(GC)不能分析的高沸点或热不稳定的农药可以进行有效的分离检测。与GC相比，HPLC的流动相参与分离机制，其组成、比例和pH值可以灵活调节，这样更有利于分离。张洪兰采用国产C18柱提取生物体液中呋喃丹等7种氨基甲酸酯类农药，用乙酸乙酯洗脱，采用二极管矩阵检测器和多通道信号检测，最低检测限为20～40 ng[3]。

3.1.1.1 HPLC-分光检测

1977年，Moye等第一次采用柱后衍生HPLC-荧光检测法测定NMCs残留。近20年来，柱后水解和衍生后进行荧光检测复杂基质中NMCs的方法已经越来越普遍。这是一个两步系统，NMCs在90℃下柱后水解生成甲胺，甲胺在有2-巯基乙醇(2-ME)存在的碱溶液中与邻苯醛酸(OPA)反应，生成强烈的荧光物质。Argauer用该方法测定了26个样品中的24种氨基甲酸酯类农药，回收率为70%～100%[4]。柱后衍生需在柱后安两个试剂运送泵，一个输送NaOH，另一个输送OPA/2-ME，并有可能产生混合和流动脉冲。此外流动相中分析物的稀释导致谱带扩展，为此，很多人做了改进工作，包括固相反应器、UV-发光反应器等。

3.1.2 HPLC-质谱检测

尽管HPLC-紫外及HPLC-荧光检测已经被广泛接受作为NMCs残留分析方法，对于极性或热不稳定性太强的氨基甲酸酯类农药(及其代谢物)，可采用高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)来检测。Doerge和Bajic用LC-APCI-MS分析了三嗪、氨基甲酸酯、取代脲和有机磷类17种杀虫剂，在全扫描状态下检测限为0.8～10.0 ng，选择离子检测限为0.01～1.00ng[5]。在土壤及农作物等复杂样品的分析中峰的分离很困难，氨基甲酸酯类农药化合物的确认存在问题，因此将HPLC与MS联机使用无疑是一个好的解决办法。采用HPLC-MS测定马铃薯样品中的呋喃丹的最低检测限可达2.5ng/g[6]。

3.1.3 气相色谱(GC)测定

用于NMCs分析的GC检测器中原子发射检测器(AED)比N-P检测器和电子捕获检测器的选择性更高，更适合于食物样品中农药残留的监测。此外，GC-AED具有宽的线性动力学范围，作为定量方法更具可靠性。NMCs衍生化以后可进行GC分析，衍生化试剂主要有五氟丙醛、三甲基巯氢氧化物(TMSH)等。虽然NMCs衍生化后进行GC分析具有较高的稳定性，较好的分离效果和较高的灵敏度，但操作复杂，耗时长，具有很大的局限性。

NMCs在GC中不稳定，即使在选择柱条件方面下很大功夫，仍不可避免NMCs的分解，于是考虑将NMCs完全水解，以测定NMCs的甲胺或酚部分，或通过热稳定衍生，对不发生分解的NMCs直接进行测定。冷柱头进样OCI(cold oN-column inject)是分析热敏化合物最好的进样技术，不会在进样过程中产生降解。杨大进等采用毛细管GC、NPD测定大米、蔬菜中6种氨基甲酸酯类农药，其准确度和精确度均较好，最低检测限为2～15μg/kg。

3.1.4 其它色谱方法

用于NMCs分析的其它仪器分析方法主要有超临界流体色谱(SFC)、薄层色谱等。Murugaverl等用SFC-MS分析涕灭威、杀草丹、恶虫威、西维因，检测限可达pg水平。

3.2 分光光度测定法

由于在分光光度分析过程中没有分离步骤，因此颜色反应的特异性就成为目标化合物定量分析的主要因素。近来分光光度分析大多数是用来分析西维因，并且采用不同的样品前处理、不同的耦合试剂和不同的波长条件下进行测定。例如，可先将西维因氧化成1-奈酚，固定于固相吸附剂上，然后用分光光度计测定水样中的西维因；也可用SPE浓缩西维因，经过洗脱和溶剂替换后，用分光光度计进行测定。

3.2.1 分光光度速测仪

利用胆碱酯酶的水解生理活性，模拟有机磷、氨基甲酸酯类农药杀虫毒理，采用紫外分光光度计比色法来判断样本中的农药残留总体情况。采用该方法研制的农药残毒快速检测仪器是目前最主要的速测设备，有些检测灵敏度高达015mg/L(甲胺磷)、01003mg/L(呋喃丹)，可以与色谱仪的灵敏度相媲美。仪器的设计也逐渐自动化、小型化、便携化，使得农产品质量安全检测流动实验室迅速发展。

4 生物检测方法

4.1 活体生物测定法

活体检测法是使用活的生物直接测定。袁东星等利用发光菌进行农残检测，该方法的最小检出浓度为3mg/L[7]。袁振华等以大型水蚤为试验材料，对蔬菜中农残作了监测，研究表明大型水蚤测试技术完全适用于蔬菜中的农残测定[8]。20世纪60年代后期，台湾农业试验所采用生物测定法进行农残检验，其原理是放饲高敏感性的家蝇于菜汁中，4～5h后家蝇死亡率在10%以下即为合格[9]。

4.2 乙酰胆碱酯酶抑制法

乙酰胆碱酯酶抑制法是研究最多且相对成熟的一种对部分农药进行残留快速检测技术。乙酰胆碱酯酶抑制法是利用有机磷与氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，破坏神经的正常传导，使昆虫中毒致死这一毒理学原理，将AChE与样品反应，根据AChE活性受到抑制的情况，可判断出样品中是否含有有机磷与氨基甲酸酯类药。但乙酰胆碱酯酶抑制法测定范围有限，目前仅用于蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸酯类农残的检测，且该方法对常见农药的检出限为0.3～3.5 mg/kg，均高于相应农药的最大残留限量，因此只能作为初步定性筛选检测法[10]。

4.3 植物酶抑制法

近年来发展了用植物水解酶替代乙酰胆碱酯酶的分析方法，植物酶抑制法的原理是利用植物水解酶水解2,6-二氯乙酰靛酚，根据反应溶液在水解前后颜色的变化，用眼睛或仪器辨别农药对酶的抑制程度，在有机磷或氨基甲酸酯类农药存在时，植物水解酶的活性受抑制，靛酚的蓝色变浅。钟树明等利用硅藻土有效去除叶绿素且不影响样品中农药的浓度，提高了测试的灵敏度[11]。

4.4 免疫分析法(IA)

免疫分析技术（ELISA）是将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的测定技术，其核心技术是抗原抗体的特异性反应。固相酶联免疫测定法对一种化合物或一组化合物具有特异性，减少基质的干扰，不需样品净化和浓缩。能否合成稳定，具有良好免疫原性-载体蛋白结合物是整个农药残留免疫学检测技术研究的关键[12]。在ELISA检测过程中，酶催化具有高度的放大作用，不仅可以定性分析而且可以进行定量分析。目前市场上能够买到的分析氨基甲酸酯类农药的ELISA试剂盒有多种，其中主要是涕灭威、西维因、呋喃丹及其代谢产物试剂盒。Lehotay等应用一种商品试剂盒测定了肉和肝样中的呋喃丹和涕灭威砜，并直接检测了牛奶、血和尿中的涕灭威砜。

5 结 语

综合氨基甲酸酯类农药是有害生物控制中广泛应用的一类农药，其残留定量分析也是一门综合性很强、涉及面很广的分析学科。目前实验室分析仍然以色谱为主，但将更多地使用选择性检测器，如色谱-质谱联用、串联质谱、傅立叶红外变换仪等，随着科学技术的不断发展和各种新技术的应用，利用色谱技术的传统实验室分析模式将被两步分析模式代替，即先利用免疫技术、生物传感器、手提式色谱或光谱仪等进行初筛，再在实验室对呈阳性的样品进一步进行定量分析。氨基甲酸酯类农药残留定量分析方法将日趋系统化、规范化，并向小型化、自动化方向发展。同时，由于在线联用技术可避免样品转移的损失，减少各种人为的偶然误差，也将是今后农药残留定量分析方法的一个重要发展方向。

不同样品介质中NMCs的测定仍是令人感兴趣的一个课题。较新的分析技术，如SPE小柱、SFE、免疫亲和柱等越来越多地在NMCs分析样品前处理过程中得到应用。SFE的应用尤其有助于降低化学试剂的使用量。最近发展的用于确证极性热不稳定NMCs农药分析的HPLC-MS在灵敏度、选择性方面都有显著的改善。除HPLC、GC和TLC等色谱分析方法外，非色谱分析方法(如免疫检测等)也为NMCs的残留分析提供了有效的分析工具。

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Analysis of NMCs Pesticide Residues in Progress

Yao Jingjing1， Yuan Youming1，Wang Mingrui1，Liao Li2

（1.Food Quality Inspection and Testing Center (Wuhan),Ministry of Agricultural Wuhan 430064 China;2.Institute for Farm Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology, Hubei Academy of Agricultural Sciences Wuhan 430064 China）

Abstract: This article summarized the HPLC, GC and its the corresponding sample the processing method, as well as in the last few years uses in the carbaminate agricultural chemicals determination new technical like supercritical fluid to withdraw, the supercritical fluid chromatograph, the gas-nature oN-line and some nonchromato-graphtechnology like immunity examinations, the biosensor and the electrochemistry examination and so on.

Key words: NMCs; pesticide residuce; analysis method; progress