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(1.广东药学院 中山校区实验中心,广东 中山 528458;2.广州中医药大学 实验动物中心,广东 广州 510405)
胃癌是一种常见的对人类危害较大的疾病,我国在20世纪90年代进行的全国恶性肿瘤死亡率调查表明,胃癌死亡率高居恶性肿瘤死亡率的首位[1],目前使用手术、化疗、放疗等治疗方法存在许多局限,而且不能有效防治胃癌的转移和复发。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是从活血化瘀中药川芎中分离得到的一种生物碱,主要应用于缺血性心、脑血管疾病,毒副作用少。有研究发现[2],川芎嗪对MKN45人胃癌低分化腺癌细胞有直接的杀伤作用;张薇等[3]的研究则显示川芎嗪能抑制胃癌前病变大鼠新生血管生成,可能对胃癌具有一定的预防和治疗作用。本文拟通过MTT比色法观察川芎嗪对胃癌细胞和血管内皮细胞增殖的影响,初步探讨川芎嗪在胃癌治疗中的作用和意义。
1.1 材料 RMPI 1640培养基(美国Gibco),SFM培养基(美国Gibco),胎牛血清(FBS,杭州四季青),谷氨酰胺(美国Amresco,博理分装),重组人β内皮细胞生长因子(rhβ-ECGF,美国R&D),F8兔抗人多克隆抗体、FITC-羊抗兔IgG(武汉博士德),盐酸川芎嗪注射液(常州制药厂有限公司,规格:40 mg/2 mL,批号:0403231),MTT(美国Amersco,博理分装)。
1.2 方法
1.2.1 胃癌细胞培养 SGC-7901胃腺癌细胞(购自中国科学院上海细胞库),用RMPI 1640完全培养基(加入10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺)培养。
1.2.2 HUVEC培养 采用胰蛋白酶消化法分离获取[4-5]。用内皮细胞培养基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1 ng/mL rhβ-ECGF的SFM培养基)培养,传代后用第八因子相关抗原免疫荧光染色法进行鉴定。HUVEC第3~6代用于实验。
1.2.3 川芎嗪对细胞增殖影响的检测
1.2.3.1 对胃腺癌细胞增殖的影响 SGC-7901胃腺癌细胞以1×104个/mL的密度接种于96孔板内,每孔接种100 μL,用RMPI 1640完全培养基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺)培养。培养24 h后,吸弃孔中培养基。每块培养板分4组,每组6个复孔。正常对照组加入100 μL/孔RMPI 1640完全培养基;川芎嗪组则将含川芎嗪25 μg/mL,125 μg/mL,625 μg/mL的RMPI-1640培养基依次加入相应的孔中,每孔100 μL。药物作用第24、48、72 h取出一块培养板,MTT法检测细胞增殖情况(检测490 nm处光吸收值)。
1.2.3.2 对无因子培养HUVEC细胞增殖的影响 HUVEC以2×104个/mL的密度接种于96孔板内,每孔接种100 μL,用SFM完全培养基(含10%胎牛血清和2 mM谷氨酰胺)培养。培养24 h后,吸弃孔中培养基。每块培养板分4组,每组6个复孔。正常对照组则加入100 μL/孔SFM完全培养基;川芎嗪组则将含25 μg/mL,125 μg/mL,625 μg/mL的SFM完全培养基依次加入相应孔中,每孔100 μL。分别在药物作用第24、48、72 h取出一块培养板,MTT法检测细胞增殖情况(检测490 nm处光吸收值)。
1.2.3.3 对胃腺癌细胞条件培养基诱导的HUVEC增殖的影响 胃腺癌细胞接种于75 cm2培养瓶内,每瓶接种以1.5×106个/mL,加入SFM完全培养基至5 mL。培养48 h后,将培养上清吸至同一离心管内,1 500 r/min离心10 min。离心后的上清收集于新的离心管内,-20℃冻存备用。
HUVEC以2×104个/mL的密度接种于96孔板内,每孔接种100 μL,共接种3个培养板,用SFM完全培养基培养。培养24 h后,吸弃孔中培养基。每块培养板分7组,每组6个复孔。正常对照组加入100 μL/孔的SFM完全培养基;条件对照组加入100 μL/孔的条件培养基(将上述收集的胃腺癌细胞培养上清与SFM完全培养基按1∶1的比例混匀);川芎嗪组将含川芎嗪终浓度为25 μg/mL,125 μg/mL,625 μg/mL的条件培养基依次加入相应各孔中,每孔100 μL。分别在药物作用第24、48、72 h取出一块培养板,MTT法检测细胞增殖情况。
1.3 统计学分析 上述实验各进行2次,实验数据用SPSS 13.0统计软件进行处理,相同时间点均数间两两比较使用单因素方差分析,方差齐则用LSD-t检验,方差不齐用Dunnett’s-C检验。
2.1 对胃腺癌细胞的影响 经不同浓度川芎嗪作用后,HUVEC的光吸收值(A值)见表1。各川芎嗪组A值与相同时间的正常对照组相比较(P>0.05)。
表1 不同浓度川芎嗪对胃腺癌细胞增殖的影响
2.2 对HUVEC增殖的影响 经不同浓度川芎嗪作用后,HUVEC的光吸收值(A值)见表2。各川芎嗪组A值与相同时间的正常对照组相比较(P>0.05)。
表2 不同浓度川芎嗪对正常培养条件HUVEC增殖的影响
2.3 对条件培养基诱导HUVEC增殖的影响 经不同浓度川芎嗪作用后,HUVEC的光吸收值(A值)见表3;各川芎嗪浓度组抑制率见表4。各组光吸收值均随培养时间的延长而升高;条件对照组和各川芎嗪组A值高于相同时间的正常对照组,差异有显著性(P<0.05);川芎嗪浓度为125 μg/mL(川芎嗪4组)作用48、72 h、浓度为625 μg/mL(川芎嗪5组)作用24、48、72 h对SGC-7901胃癌细胞条件培养基诱导的HUVEC增殖有明显影响(P<0.05),川芎嗪浓度为125~625 μg/mL时,增殖抑制率随着作用时间的延长而升高(见表4)。
表3 不同浓度川芎嗪对条件培养基诱导的HUVEC的增殖的影响
表4 不同浓度川芎嗪对条件培养基诱导HUVEC增殖的抑制
川芎嗪在临床主要应用于缺血性心、脑血管疾病,同时能通过直接抑制肿瘤、化疗增效与减毒作用、调节免疫机制等作用达到抗肿瘤效应;能通过下调肿瘤多药耐药基因蛋白(P-gp)而克服肿瘤细胞耐药性;通过影响肿瘤细胞黏附与侵袭、抗凝血与抗血小板集聚作用而发挥抗肿瘤转移作用[5]。研究者还发现,川芎嗪可有效抑制大鼠胃癌前病变组织和小鼠Lewis肺癌组织中微血管增生[3,6],从而减少肿瘤的增殖和转移。 本研究显示,川芎嗪对SGC-7901细胞和HUVEC无直接杀伤作用,但对胃癌细胞条件培养基诱导HUVEC的增殖具有抑制作用。反映川芎嗪可通过抑制肿瘤血管生成而发挥预防和治疗作用。肿瘤细胞能分泌各种促血管生成因子,这些因子与其相应的受体相结合,是促使肿瘤新生血管增殖、迁移和形成管腔的重要原因[7-8],故川芎嗪对胃癌细胞条件培养基诱导的HUVEC增殖的抑制作用,可能与影响胃腺癌细胞条件培养基中促血管生长因子与其受体结合的中间环节有关。研究表明[9-10],川芎嗪抑制肿瘤新生血管生成的作用可能与抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达有关,但川芎嗪对这两种因子影响的具体作用机制目前不甚明了,是否对其它因子或受体具有抑制作用也尚未清楚,因此要明确川芎嗪抑制肿瘤新生血管生成的具体机制和作用环节仍需进一步研究。
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