益肾饮合雷公藤多苷对肾炎大鼠卵巢病理及一氧化氮合酶的影响

于俊生，王瑶瑶，杜雅静

(青岛市海慈医疗集团，山东 青岛 266033)

研究发现，雷公藤的自身免疫治疗剂量明显高于其有效抗生育阈剂量[1]，说明雷公藤在发挥免疫抑制作用的同时，不可避免地影响到生殖功能。我们在既往的研究中证实，益肾饮合雷公藤多苷治疗慢性肾炎有减毒增效的作用[2-3]。本实验选用慢性系膜增生性肾小球肾炎模型大鼠，探讨益肾饮拮抗雷公藤多苷对系膜增生性肾炎雌性大鼠性腺损害的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 清洁级Wistar雌性大鼠25只，6～8周龄，体重(200±20)g，由山东省鲁抗动物房提供(鲁20050017)。于室温23℃,用标准大鼠饲料喂养。造模前预养1周，随机分为正常对照组、模型组、雷公藤多苷组、益肾饮组、雷公藤多苷与益肾饮合用组(以下简称合用组)，每组5只。

1.2 药品与试剂 益肾饮:当归15 g，赤芍15 g，川芎10 g，茯苓15 g，泽泻10 g，白术15 g，熟地黄15 g，肉苁蓉15 g(由青岛市海慈医疗集团制剂科配制)，含生药2.2 g/mL。按大鼠100 g体重每天用量2.2 g。雷公藤多苷：10 mg/片(由浙江普洛康裕天然药物有限公司提供)，配成2.4 mg/mL；按大鼠100 g体重每天用2.4 mg。牛血清白蛋白(BSA)购自瑞士罗氏公司；弗氏佐剂购自美国sigma公司;一抗(iNOS)兔抗鼠多克隆抗体，二抗：羊抗兔iNOS，PV9000均购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3 系膜增生性肾小球肾炎大鼠模型建立[4]4组大鼠适应性喂养1周，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，常规消毒后经背部切除左侧肾脏，休养1周。大鼠足垫皮下注射完全弗氏佐剂0.1 mg加3 mg BSA,于1、2周末加强2次。3周末，腹腔连续4次注射BSA，间隔时间为1 h，注射剂量分别为每只0.5、1.0、1.5、3.0 mg；次日晨加强1次(2.0 mg/只)。之后每日腹腔注射BSA,剂量从每只0.5～5.0 mg开始，每日增加0.5～5.0 mg,继续每周加量1 mg至10 mg为止。正常对照组大鼠，手术造模时开腹游离左侧肾脏后关腹,药物造模时给予相应剂量的生理盐水注射。造模5周时，雷公藤多苷组、益肾饮组、合用组分别用相应药物灌胃,共灌胃8周。正常对照组和模型组灌以相同剂量的生理盐水。

1.4 观察指标

1.4.1 卵巢组织的病理变化 于12周末宰杀大鼠后取卵巢以滤纸吸干用分析天平称重，计算卵巢脏器指数。之后取子宫置于10%的中性甲醛固定液中固定，进行病理切片、光镜HE染色测定。

1.4.2 免疫组化染色步骤(PV9000二步法)(略)

2 结果

2.1 各组性腺脏器指数的变化 见表1。

2.2 卵巢和子宫组织病理改变

2.2.1 卵巢 光镜下，正常对照组和模型组卵巢组织结构正常,可见各级生长卵泡、成熟卵泡及黄体。成熟卵泡中可见卵丘、卵泡液及卵细胞，卵泡液丰富，颗粒细胞层次多；黄体发育好。雷公藤多苷组大鼠卵巢较正常对照组和模型组略偏小，可见生长卵泡、成熟卵泡及黄体，成熟卵泡数、黄体数较少，卵泡较小，颗粒细胞层次较少，黄体偏小。益肾饮和合用组卵巢可见各级生长卵泡、成熟卵泡及黄体。颗粒细胞层次多，黄体发育好。

表1 各组性腺脏器指数变化情况

2.2.2 子宫 正常对照组和模型组大鼠子宫管径均匀，内膜被覆高柱状上皮,浆内有核下空泡；腺体丰富，腺体呈圆形、椭圆形，腺体上皮呈高柱状。雷公藤多苷组大鼠子宫管径细，内膜上皮薄，腺体含量少；子宫肌层较正常对照组薄，肌纤维排列较稀疏。益肾饮组和合用组大鼠子宫管径正常，内膜被覆高柱状上皮，腺体丰富。

采用动物图像分析系统，扫描显示图像观察卵巢卵泡数量及子宫内膜厚度，见表2。

表2 各组雌鼠卵泡数量、子宫内膜厚度变化情况

2.3 卵巢中iNOS表达 将二步法染色切片置于Olympus显微镜400×/下观察，随机选择5个视野，每个视野计数100个细胞，分别读出其中阴性(-)、弱阳性(+)、阳性(++)和强阳性(+++)的细胞数。免疫组化评分(IHS)参照文献[5]，结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分。结果：正常对照组在卵巢卵泡颗粒细胞内可见iNOS阳性细胞，雷公藤多苷组阳性细胞数量减少，表达减弱，与正常对照组及益肾饮组对比有统计学意义(P<0.01),合用组与正常对照组相比无差异(P>0.05)。

3 讨论

中药拮抗雷公藤多苷抗生育活性的研究已取得新进展[6-8]。我们认为雷公藤多苷毒副作用的中医病机关乎“精血受损，肝脾肾三脏功能失调”[9]；并据此提出调补肝肾、健脾利湿、养血活血治则，以经方当归芍药散加熟地黄、肉苁蓉组成益肾饮。当归芍药散出自《金匮要略·妇人妊娠病脉证篇》，仲景本方原为妇人怀孕腹中疼痛而设，有养血疏肝、健脾渗湿、安胎止痛之功效，乃疏肝健脾之名方。方中当归补血活血，芍药养血柔肝，川芎行气疏肝、活血化瘀；茯苓健脾渗湿，泽泻利水渗湿，白术补气健脾燥湿。加入熟地黄、肉苁蓉以补肾填精，二者相配体现了阴中求阳、阳中求阴的原则。熟地黄配当归、芍药增强了填精养血之功；熟地黄配川芎，使熟地补而不滞、滋而不腻，使川芎行而不破；熟地黄配茯苓、泽泻、白术使祛湿而不伤阴；肉苁蓉补肾助阳，温热之性助当归、川芎活血行气，同时温煦脾阳助茯苓、泽泻、白术健脾祛湿，共奏调肝补肾、健脾除湿、养血活血之功效。体现了标本兼治、湿瘀同治、肝脾肾三脏同治的原则。

在前期的研究中已经证实，益肾饮与雷公藤多苷合用可减轻大鼠系膜增生性肾小球肾炎因应用雷公藤多苷所致的肝肾损害[2]，提高血清蛋白水平，且影响肾脏中TNF-α、IL-6的表达[3]。本实验观察到应用雷公藤多苷治疗系膜增生性肾炎同时应用益肾饮，卵巢iNOS活性比雷公藤多苷组显著提高,与正常对照组相近，说明益肾饮通过影响iNOS活性来改善雷公藤多苷对生殖系统的损害。

[1]路秀英,徐 铮,修贺明,等.抗生育剂量雷公藤对小鼠免疫功能的影响[J].生殖与避孕,1998,18(2):116-18.

[2]吴桂艳,于俊生,卫艳玲.益肾饮拮抗雷公藤多苷治疗大鼠系膜增生性肾炎中致肝损伤的实验研究[J].中华实用中西医杂志,2006,19(11):1243-1246.

[3]于俊生,吴桂艳,卫艳玲.益肾饮合雷公藤多苷对系膜增生性肾炎大鼠TNF-α和IL-6蛋白表达的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2008,9(3):225-227.

[4]贾 慧,邹万忠.改良慢性血清病性大鼠系膜增生性肾炎模型的建立[J].肾脏病与透析肾移植杂志,1996,1(3):21

[5]Soslow RA,Dannenberg AJ,Rush D,Woerner BM,Khan KN,Masferrer J,Koki AT[J].Cox-2 is expressed in human.pulmonary,colonic,and mammary tumors.Cancer 2000(89):2637-2645.

[6]林金芳,于传鑫.高促性腺激素继发闭经的临床研究[J].中华妇产科杂志,1996:278-282.

[7]胡 兵,董晓蕾,陈林囡,等.当归芍药散拮抗雷公藤对雌鼠生殖系统影响的实验研究[J].时珍国医国药,2000,11(9):775-776.

[8]王瑶瑶,于俊生.中药拮抗雷公藤多苷抗生育活性的研究[J].吉林中医药,2008,28(2):143-144.

[9]卫艳玲,于俊生.雷公藤多苷治疗肾脏疾病所致毒副作用中医病机的探讨[J].中华医学百科杂志,2006,8(2):36.