解毒通络保肾散对晚期糖基化终末产物肾毒性影响的实验研究

何 泽，南 征，李 才

(1.长春中医药大学附属医院 糖尿病科，吉林 长春 130021;2.长春中医药大学附属医院 中医研究所，吉林 长春 130021;3.吉林大学再生医学研究所，吉林 长春 130021)

解毒通络保肾散是我们经临床研究治疗糖尿病肾病(DN)的有效中药复方，由中药大黄、黄连、金银花、黄芪等药物组成，具有益气养阴、活血化瘀、解毒通络之功效，临床应用10年，取得了较好的临床疗效，初步显示了防治DN的优势。为了进一步观察解毒通络保肾散的防治机理，本实验拟观察AGEs对正常大鼠肾脏功能的毒害作用及解毒通络保肾散的拮抗AGEs的作用，为寻找抑制非酶糖化反应的有效中药、防治并发症提供可行的途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠，体重170～200 g，由吉林省实验动物中心提供，饲料由吉林省实验动物中心提供的常规大鼠饲料，实验期间大鼠自由摄食和饮水，适应性喂养1周，取尿糖、尿蛋白阴性的健康状况良好的动物为实验对象。

1.2 主要试剂和药品 中药解毒通络保肾散(长春中医药大学附属医院制剂室提供)，氨基胍(美国Sigma公司)，尿微量白蛋白酶免法试剂盒(上海德波生物技术有限公司)。

1.3 主要仪器 医用离心机(北京)，721(722)型分光光度计(上海)，日立7150型生化自动分析仪(日本)，RF-540型荧光分光光度计(Shimida,日本)，PHS-3C型酸度计(上海),HZS-H水浴振器(哈尔滨)。

1.4 体外注射糖基化血清蛋白(GSP)的制备 取正常混合大鼠血清，经56℃、30 min灭活后，在体外糖基化体系制备GSP。按血清蛋白终浓度5 mg/mL、葡萄糖500 mmol/L、青霉素和链霉素各100 u/mL,溶于PBS(pH 7.2)，经Gs漏斗抽滤后置37℃、密闭避光环境中反应2个月。用透析袋透析72 h以除去葡萄糖，再次用Gs漏斗抽滤取样检测相对荧光值、果糖胺、5-HMF及葡萄糖含量后分别冻存。对照组血清蛋白(天然血清蛋白)除不含葡萄糖外，其他成分及反应过程均同GSP，并在透析后加入葡萄糖，使与GSP中葡萄糖含量相等后冻存。

1.5 体外注射GSP的动物模型分组及处理因素

1.5.1 大鼠适应性喂养1周后，禁食12 h,将尿糖、尿蛋白阴性者列入观察对象，按体重随机选取50只，均分为5组，每组10只。正常组不加任何处理；单纯血清组每日1次尾静脉注射单纯血清100 mg/kg；糖化血清蛋白组、氨基胍组、解毒通络保肾散组分别每日1次尾静脉注射糖化血清蛋白液100 mg/kg，以上4组注射剂量由每只鼠0.5 mL逐渐增至1.5 mL，每日1次，共注射1个月。其中解毒通络保肾散组每日上午灌服解毒通络保肾散浓缩液6 g/kg体重(按生药计)、氨基胍组每日上午腹腔注射氨基胍40 mg/kg体重，其余3组均灌胃等体积蒸馏水,实验1月后，取血、尿、组织标本测相应指标。

1.5.2 实验结束前两天，将大鼠放入代谢笼内收集24 h尿液。收集尿液期间动物禁食，自由饮水，尽量减少声、光等对动物的刺激。收集尿液记录体积后，按待测指标要求进行样品预处理，留样本于4 ℃待测。

1.5.3 实验结束时，大鼠麻醉下眶后血管采血，肝素抗凝，1 500r/min,离心30 min后，分离血清，-20℃冻存。快速切除肾脏，取左肾，称重，部分肾脏切成小块，经2.5%戊二醛/0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4)固定后用于后期病理标本制备；部分肾脏经10%中性福尔马林液固定，制备石蜡切片。取右肾液氮冷冻检测AGEs含量。

1.6 观察指标 各组大鼠一般情况、血清生化指标检测：包括血糖、肾功能(血清肌酐、尿肌酐、尿素氮)、尿蛋白、尿微量白蛋白含量测定、肾重、血清、肾组织AGEs含量的测定等。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态比较 各组大鼠精神状态、毛色、饮水量、尿量、体重等无明显差异(P>0.05)。

2.2 各组大鼠血清生化指标比较 各组大鼠尿素氮、血肌酐、总胆固醇、血糖均无明显差别(P>0.05)。

2.3 各组大鼠肾重/体重比值结果 见表1。

表1 各组大鼠肾重/体重比较

2.4 各组大鼠24 h尿总蛋白、尿总白蛋白比较 见表2。

表2 各组大鼠24 h尿蛋白、尿总白蛋白比较

2.5 各组大鼠血清及肾组织AGEs含量比较 见表3。

表3 各组大鼠血清及肾组织AGEs含量比较

3 讨论

糖尿病肾病(DN)的发生发展是多因素综合作用的结果，其中非酶糖化及其终末产物AGEs在DN的发生和发展中起着重要作用，同时在糖尿病(DM)时肾脏易受到AGEs的损害。肾小球基底膜增厚和以肾小球系膜区为主的细胞外基质(ECM)积聚是DN的基本病理特点。检测体内AGEs水平，对中西医进一步研究DM慢性并发症的发生、评估程度、监测长期血糖控制水平以及指导DM治疗，阻断高血糖的远端效应等均具有十分重要的意义。由于至今尚未完全弄清楚其结构,因此在实验中若直接应用AGEs或AGEs的修饰物是比较困难的。而用糖基化血清蛋白(GSP)观察其对肾脏功能的影响是适宜的。AGEs在DN中的一个重要作用是引起ECM的分子结构及组成改变。从而引起基质功能的改变。体内给予AGEs能引起正常大鼠发生类似DN的组织学改变和病理生理改变[4-6]。

本实验结果显示，解毒通络保肾散组、氨基胍对照组大鼠尿微量白蛋白均明显低于糖化血清蛋白组(P<0.01),尿微量白蛋白主要反应肾小球滤过功能，AGEs分子间的异常交联增多，胶原纤维之间的正常交联减少，造成肾小球率过孔径增大，是出现蛋白尿的形态基础。与糖化血清蛋白组比较，解毒通络保肾散组血清及肾组织AGEs含量明显降低(P<0.01)。结果提示：AGEs的形成、堆积与DM肾脏损害及白蛋白尿的排泄密切相关，而中药解毒通络保肾散具有拮抗AGEs的毒害作用。

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