SFRP 2与Periostin的相互作用在瘢痕疙瘩形成机制中的研究

王珍祥 袁顺宗 陶熹 李世荣 吴军

SFRP 2与Periostin的相互作用在瘢痕疙瘩形成机制中的研究

王珍祥 袁顺宗 陶熹 李世荣 吴军

目的利用pull-down技术验证凋亡相关蛋白基因SFRP 2（Secreted frizzled-related protein 2）和骨母细胞特异性因子-2 Periostin（Osteoblast-specific factor 2）间的相互作用。方法构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的Periostin融合蛋白（HA-Periostin）的重组载体pCMV-HA-Periostin，经酶切鉴定正确后，和表达带Myc标签的融合蛋白（Myc-SFRP 2）的重组真核表达载体pCMV-HA-SFRP2，单独或共转染人293细胞，利用pull-down技术验证Periostin与SFRP 2间的相互作用。结果成功构建重组载体pCMV-HA-Periostin，与抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-SFRP 2相互作用蛋白复合物后，可以检测到HA-Periostin的表达。通过体外蛋白质结合实验证实了Periostin与SFRP 2间的相互作用。结论成功构建带HA标签的Periostin融合蛋白（HA-Periostin）的重组载体，利用pull-down技术证实了Periostin与SFRP 2间的存在相互作用。

凋亡相关蛋白基因骨母细胞特异性因子-2相互作用

瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡功能抑制的相关信号途径研究，尚缺少文献报道[1]。本课题组对同体瘢痕疙瘩和正常皮肤内差异表达的基因进行了基因芯片筛选，确定了显著高表达基因SFRP 2（Secreted frizzled-related protein 2)[2]。进一步在原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常成纤维细胞中，利用RTPCR技术从基因水平上证实SFRP 2基因在前者中的表达要显著高于后者。SFRP 2蛋白可能是调控瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的新的重要信号分子。但是，SFRP 2如何在成纤维细胞中发挥其抑制凋亡功能尚不清楚。我们利用酵母双杂交技术对SFRP 2的相互作用蛋白进行初步筛选，获得了一个能间的相互作用。分别构建了SFRP 2的融合蛋白Myc-SFRP 2和Periostin的融合蛋白HA-Periostin的表达载体pCMV-HA-SFRP 2和pCMV-HA-Periostin，验证构建成功后，利用免疫共沉淀验证SFRP 2与Periostin间是否存在相互作用。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、含SFRP 2基因序列的重组载体pCMV-Myc-SFRP 2和含Periostin编码序列的重组载体pACT2-Periostin均为本课题组保存。pCMVHA载体、Myc单抗和HA多抗购自美国Clontech公司，HRP标记的羊抗兔IgG及化学发光液购自武汉博士德公司，细胞裂解液RIPA购自美国Santa Cruz公司，蛋白标准品及其检测抗体购自日本TaKaRa公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Omega公司；DNA、蛋白质相对分子量标准购自北京鼎国生物技术公司；Anti2Syntro2phin单抗、ECL Western印迹检测试剂盒购自美国Chemicon公司。1.2方法

1.2.1 重组载体pCMV-HA-Periostin的构建

分别根据pACT2-Periostin和空载体pCMVHA的特点，进行Sfi I和Xho I双酶切；0.6%琼脂糖凝胶电泳酶切产物后，切割含目的片段和载体的凝胶，回收；T4 DNA连接酶转化，质粒扩增，用Sfi I和Xho I双酶切鉴定，并凝胶电泳酶切。

1.2.2 融合蛋白的诱导表达

1.2.2.1 GST-SFRP2融合蛋白在宿主菌中的诱导表达及纯化

将测序正确的重组表达载体转化到宿主菌中，按常规实验方法[12]得到纯化的融合蛋白琼脂糖株，-20℃保存备用。

1.2.2.2 His-Periostin融合蛋白在宿主菌中的诱导表达

将保存的重组表达载体pACT2-Periostin转化到宿主菌中，按常规实验方法[12]收集上清，即为含有His-Periostin融合蛋白的细菌裂解液，每管1 mL分装待用或-80℃保存。

1.2.3 瘢痕疙瘩组织裂解液的制备

取瘢痕疙瘩组织，用冰冷的PBS洗净，每克组织中加入10 mL裂解液，然后用匀浆器冰浴、离心，取上清即为瘢痕疙瘩组织裂解液。

1.2.4 GST pull-down

将等量纯化的GST和GST-SFRP 2分别加入1 mL瘢痕疙瘩组织裂解液中，4℃持续混和3 h。按常规方法处理，收集沉淀，即为GST pull-down沉淀复合物。

1.2.5 Western印迹

参照文献[3]的方法，电泳，蛋白转移，加入抗His标签的抗体，洗膜二抗孵育，参照ECL化学发光试剂盒说明书于暗室内发光曝光。

2 结果

2.1 重组载体pCMV-Myc-SFRP 2和pCMV-HAPeriostin的鉴定

经酶切、电泳后获得的图谱显示(图1)，近800 bp处的条带为酶切后的目的片段SFRP 1编码基因（图1，条带3），近2 500 bp处的条带为酶切后的目的基因Periostin(图2，条带2)，表明pCMV-Myc-SFRP 2和pCMV-HA-Periostin分别构建成功。实验重复3次，结果均一致。

图1 pCMV-Myc-SFRP 2重组载体酶切后的琼脂糖凝胶电泳图

图2 pCMV-HA-Periostin重组载体酶切后的琼脂糖凝胶电泳图

2.2 利用pull-down再次证实SFRP 2和Periostin间存在相互作用

经pull-down实验显示，在单独加入GST-SFRP 2融合蛋白或His-Periostin融合蛋白的细菌裂解液到瘢痕疙瘩组织裂解液中时，仅仅显示自身1个条带，没有相互作用，而一旦同时加入GST-SFRP 2融合蛋白和His-Periostin融合蛋白的细菌裂解液到瘢痕疙瘩组织裂解液中，不管是His pull-down还是GST pull-down，都检测出GST-SFRP 2和His-Periostin两个条带，说明它们存在相互作用（图3）。

图3 分别利用His pull-down和GST pull-down技术证实SFRP 2和Periostin间存在相互作用

3 讨论

凋亡在创伤愈合中具有重要作用，随着细胞外基质的产生和降解，细胞的增殖和凋亡保持平衡。而瘢痕疙瘩中成纤维细胞的凋亡和增殖发生改变，大量研究表明KFs的凋亡率要低于NFs，其中已证实p53、p63和p73参与了病理性瘢痕的发展，尤其是p53在瘢痕疙瘩中的表达要远高于在正常和增生性瘢痕中的表达，且p53的突变能够引起KFs的凋亡[4]。因此，创伤愈合过程中成纤维细胞的活化、增殖、凋亡抑制，以及其分泌的胶原引起细胞外基质的大量沉积，是引起瘢痕疙瘩的主要病理机制。目前已证实的TGF-β、PDGF、CTGF和p53等分子的功能可部分揭示瘢痕疙瘩的发病机制，同时也有研究表明瘢痕疙瘩中还存在着其他更多的分子信号机制[5-6]。

SFRP 2位于4q31.3，其全长约2 kb，表达于胞浆，也可分泌至胞外，其主要功能为抑制细胞凋亡。SFRP 2通过调控Wnt信号发挥其调节细胞抗凋亡的作用[7]。在进一步对纤维化相关的基因芯片筛选和差异蛋白表达的文献分析的基础上，我们认为SFRP 2在瘢痕疙瘩中可能具有更重要的功能，其原因在于：①另一研究小组利用基因芯片技术筛选了同体瘢痕疙瘩和正常皮肤的差异表达基因，结果表明在所筛选出与凋亡相关的基因中，SFRP 2基因在瘢痕疙瘩中也呈显著高表达[8]；②从瘢痕疙瘩分离的成纤维细胞在体外培养经氢化可的松处理前后，表达变化同样存在着明显差异。

Periostin，即骨母细胞特异性因子2（Osteoblastspecific factor 2，OSF-2），位于人染色体13q13.3，全长约3 kb，编码一个大小为90 kD左右的可溶性胞浆蛋白质。该蛋白可分泌至细胞外基质中发挥作用。既往研究表明，Periostin能够促进Ⅰ型胶原的生成，在以瘢痕疙瘩为代表的纤维化疾病中可能具有非常关键的功能，其主要原因在于：①瘢痕疙瘩与正常皮肤组织的基因芯片筛选结果显示，Periostin在瘢痕疙瘩中高表达[10-11]；②在蛋白水平上，与正常组织相比，瘢痕疙瘩组织中Periostin在蛋白水平上的表达同样表现为增高；③Periostin基因敲除后会导致心肌创伤愈合时成纤维细胞数量减少、胶原原纤维形成受损，引起心肌纤维化修复失败，并且Periostin可通过PI3K、MAPK和整合素等下游分子调控心肌细胞的增殖；④Periostin与Ⅰ型胶原蛋白间存在相互作用，调控真皮结缔组织中胶原原纤维的形成。故Periostin在瘢痕疙瘩组织中表达增高，是瘢痕相关基因；Periostin蛋白在瘢痕疙瘩形成中可能发挥重要作用[9]。

本实验分别成功构建了SFRP 2的融合蛋白Myc-SFRP 2和Periostin的融合蛋白HA-Periostin的表达载体pCMV-HA-SFRP 2和pCMV-HAPeriostin。近800 bp处的条带为酶切后的目的片段SARP 1编码基因，近2 500 bp处的条带为酶切后的目的基因Periostin。随后，利用His pull-down及GST pull-down验证一旦同时加入GST-SFRP 2融合蛋白和His-Periostin融合蛋白的细菌裂解液到瘢痕疙瘩组织裂解液中，不管是His pull-down还是GST pull-down，都检测出GST-SFRP 2和His-Periostin两个条带，说明Periostin和SFRP 2间存在相互作用。现有的文献报道也表明Periostin和SFRP 2在瘢痕疙瘩、器官纤维化中的表达与正常组织相比，二者在基因水平上均同时表达增高[11]；SFRP 2的功能以抑制成纤维细胞凋亡为主，Periostin的功能以调控成纤维细胞的胶原生成占主导，这些功能便与瘢痕疙瘩形成的主要分子机制即成纤维细胞凋亡受抑和活化的成纤维细胞生成、分泌胶原过多相对应，提示SFRP 2和Periostin间的相互作用可能是瘢痕疙瘩形成中的重要分子机制。

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Experimental Study of Interaction between SERP 2 and Periostin in the Formation of Keloid

WANG Zhenxiang, YUAN Shunzong,TAO Xi,LI Shirong,WU Jun.Department of Plastic Surgery and Institute of Burn,Southwest Hospital, Affiliated Third Military Medical University,Chongqing 400038,China.Corresponding author:LI Shirong,WU Jun.

ObjectiveTo investigate the interaction between Periostin（osteoblast-specific factor 2）and SFRP 2(Secreted frizzled-related protein 2)in the formation of keloid.MethodsHA-tagged fusion protein(HA-Periostin)expression vector was constructed,identified and transfected into human embryo kidney 293(HEK293)cells alone or with Myc-tagged fusion protein(Myc-SFRP 2)expression vector pMCV-Myc-SFRP 2.The interaction between SFRP 2 and Periostin was detected by pull-down technique.ResultsDouble restriction enzyme digestion showed that pCMV-HA-Periostin was constructed successfully.When Myc-SFRP 2 was immunoprecipitanted,HA-Periostin was identified.And the interaction between SFRP 2 and Periostin was found by GST pull-down and His pull-down technique.ConclusionThe recombinant vector pCMV-HAPeriostin was constructed successfully.The interaction between SFRP 2 and Periostin could be identified by GST pull-down and His pull-down.

Secreted frizzled-related protein 2;Periostin;Interaction

R619+.6

A

1673－0364（2009）04－0199－04

2009年5月20日；

2009年7月19日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.005

国家重点基础研究发展规划项目（G1999054204）。

400038重庆市第三军医大学附属西南医院整形外科。

李世荣，吴军。