西瓜EST-SSR分子标记的筛选

邹明学 陈艳红 徐勇 郭绍贵 张海英 宫国义

（1.南通大学，江苏南通，226007；2.国家蔬菜工程技术研究中心）

西瓜EST-SSR分子标记的筛选

邹明学1陈艳红1徐勇2郭绍贵2张海英2宫国义2

（1.南通大学，江苏南通，226007；2.国家蔬菜工程技术研究中心）

利用国际共享获得的820条EST序列，自主设计出79对EST-SSR引物，其中有32对引物经过PCR扩增出稳定清晰的电泳条带，可以作为西瓜和相关物种的新的EST-SSR分子标记。

西瓜 EST-SSR 分子标记

我国是西瓜生产和消费大国，西瓜播种面积占世界的60%，西瓜的栽培在我国的农村经济发展中起着越来越重要的作用。近年来，以RFLP，RAPD，SSR，ARLP为代表的分子标记的发展为遗传连锁图谱的构建开创了新局面。EST-SSRs分子标记的出现使无功能分子标记向可揭示基因转录功能的分子标记转化[1]。作为功能基因的一部分序列，它比其他分子标记提供了更多的功能信息，从而使研究者对影响该性状变异的生物学途径和代谢机制有更了深层次的认识[2]。由此可见，EST方法的优点就在于它能大大缩小基因的筛选范围，提高分离基因的效率。目前GenBank上有数量庞大的EST序列数据，为EST-SSR标记的开发提供了一个巨大而有价值的来源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试西瓜EST-SSR标记筛选的亲本材料为：父本为野生西瓜（（thunb.）Mansfeld）品种，由美国Clemson大学Rhodes B B教授赠送，代号为PI296341，目前它是国际上唯一一份高抗枯萎病（Fusarium wilt）3个生理小种的材料；母本为感枯萎病的普通西瓜（（Thunb.）Mansfeld var.）品种97103。

1.2 试验方法

①基因组DNA的提取 参照Murry和Tompson（1980）的CTAB方法进行。

②EST-SSR序列的获取 本项研究从NCBI数据库中获得820条西瓜EST序列。登陆网站http://www. gramene.org/gremene/searches/ssrtool，应用SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）软件在线搜索EST-SSR，搜索的标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重复序列的重复次数分别大于或等于10，7，5，4。

③EST-SSR引物的设计 应用引物设计软件Premier 5.0设计引物。引物设计的原则为：EST序列长度大于100 bp；SSR序列的开始和结束位置分别距5＇和3＇端不少于20 bp；引物中（G+C）的比例为40%～60%，退火温度（）为54～60℃，引物长度16～20 bp，预期扩增产物长度为80～400 bp。尽量避免引物二级结构dimer，hairpin，false primer以及连续6个碱基配对的出现。

④SSR扩增与产物的检测 SSR扩增体系：总反应体系为12.5 μL，其中dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL，引物（15 ng/μL）2.0 μL，模板DNA（30 ng/μL）2.0 μL，rTaqE （5 U/μL）0.2 μL，10 buffer（含 Mg2+）1.25 μL，ddH2O 6.05 μL。

SSR扩增程序：94℃预变性2 min；94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。

SSR扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后对结果进行记录并分析。

2 结果与分析

根据与国际合作单位共享获取的820条EST序列，共设计了79对EST-SSR引物。用自主设计的EST-SSR引物对PI296341，97103和它们的F1代进行EST-SSR多态性引物筛选 （每3个泳道为一对引物，泳道顺序从左自右分别是父本、母本、F1），结果如图1所示。

图1 EST-SSR引物筛选银染照片（从左至右为WEP1～WEP28）

经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色，共有32对引物显示出稳定清晰的电泳条带，可以作为西瓜和相关物种的新的EST-SSR分子标记。

EST-SSR引物虽然是经过严格标准设计合成的，但仍然有23对引物没有扩增结果或者扩增主带不明显，原因可能一方面是引物的序列结合到2个外显子上；另一方面可能是2个引物间有一个长的内含子致使不能扩增出产物。还有一些扩增产物与预期产物长度不一致，可能一是所分析的材料中存在复等位基因，尽管编码区相同但是DNA序列不一定相同，扩增出的产物与预期的产物大小不同；二是引物特异性不够高，扩增出引物的同源序列。

EST-SSR引物由于国际合作原因目前暂不能公开。

3 小结与讨论

EST-SSR标记是基于EST或cDNA数据开发的一种分子标记。作为一种新型分子标记，EST-SSR来自表达基因，因而除具备传统基因组来源的SSR标记所有优势外，可能与基因功能表达具有直接或间接关系，从而强化了SSR标记在遗传研究中的应用。Levi A等于2007-2008年利用西瓜EST-SSR标记进行了EST-SSR分子标记在葫芦科种间转移可能性方面和遗传多样性等方面的研究[3～4]，Verma M等2008年进行了西瓜EST-SSR标记寻找方面的研究[5]。本研究利用NCBI数据库中获取西瓜的EST序列设计引物，利用抗枯萎病PI296341与感枯萎病的97103及它们杂交获得的F1代进行EST-SSR标记的筛选，是国内在西瓜研究中首次利用已经有的EST序列进行EST-SSR标记的开发和应用方面的研究，以期为以后的西瓜及葫芦科其他作物的EST-SSR标记的发展作出重要贡献。

由于目前西瓜的EST序列还比较少，可以用来开发EST-SSR标记的也还较少，随着西瓜及葫芦科其他作物的EST序列的丰富，利用EST-SSR标记的通用性借鉴葫芦科其他作物的EST-SSR引物对，会有更多的西瓜EST-SSR标记得到开发和利用，同时利用SSR标记的通用性，也可以将西瓜的SSR标记和EST-SSR标记应用到葫芦科其他物种上。

[1]Stack S，Campbell L，Henderson K，et al.Development of EST-derived microsatellitemarkersformapping and germplasm analysis in wheat[C].San Diego，California，USA：Plant&Animal GenomeⅧ Conference，January，2000：9-12.

[2]朱振东，贾继增.小麦SSR标记的发展及应用[J].遗传，2003，25（3）：355-360.

[3]Levi A,Patrick W,Davis A,et al.Interspecific transferability of watermelon EST-SSR markers in cucurbit species[J]. Hortscience,2007,42(4):1012.

[4]Levi A,Ling K,Davis A R.Est-ssrs of watermelon(citrullus sp.)useful in assessing genetic diversity among lagenaria siceraria accessions[J].Plant and Animal Genome Conference Proceedings,2008(1):643.

[5]Verma M,Arval L.Development of EST-SSRs in watermel-and their transferability tospp.[J].Journal of horticul science&biotechnology,2008,83(6):732-736.

Selection of Watermelon EST-SSR Molecular Marker

ZOU Mingxue1,CHEN Yanhong1,XU Yong2,GUO Shaogui2,ZHANG Haiying2,GONG Guoyi2

From 820 ESTs of watermelon,we have identified 87 ESTs containing perfect simple sequence repeats(SSR)of di-,tri-,tetra-or pentanucleotides.79 EST-SSR primer pairs were designed for watermelon based on the searching results.Through PCR amplifications and silver detection,32 primer pairs had successful and distinctive bands in different cultivars of watermelon.These EST-SSR markers can be taken as a new molecular marker of watermelon and related species.

Watermelon;EST-SSR;Molecular marker

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.18.004

邹明学（1973-），男，硕士，助教，研究方向为分子遗传学，电话:0513-85015438，13912299027。E-mail:greatdream001@126.com

2009-07-01