葫芦科植物离体雌核发育研究进展

邹甜　孙波　王志伟　龚思　陈泽南　孙小武

摘要：离体雌核发育诱导单倍体是植物单倍体育种的重要手段之一，笔者对葫芦科植物离体雌核发育影响因素的最新研究进展进行了综述，主要包括基因型、取样时期和取样部位、培养基、预处理、栽培季节等对葫芦科蔬菜离体雌核发育的影响，并对离体雌核发育存在的问题进行了分析和讨论，以期为葫芦科蔬菜离体雌核发育研究工作的开展提供参考。

关键词：葫芦科；离体雌核发育；单倍体育种；未受精胚珠；未授粉子房

离体雌核发育诱导单倍体是指在离体条件下未受精胚囊细胞经过诱导产生单倍体植株的过程，有未授粉子房培养和未受精胚珠培养2种途径，是单倍体育种的重要手段之一。1979年San Noeumm首次通过大麦未受精子房培养获得了单倍体植株，并第一次提出以“雌核发育”来定义这一过程。通过离体雌核发育可以迅速得到单倍体及双单倍体植株，与常规育种相比，离体雌核发育诱导单倍体技术大大加快了育种进程，提高了育种效率，丰富了种质资源。目前，利用此技术已经成功地从多种植物中获得了单倍体植株，被广泛应用于育种实践和遗传研究。葫芦科离体雌核发育研究工作从20世纪90年代开始进行，并成功在西葫芦、甜瓜、黄瓜上获得了单倍体或双单倍体植株。近几年来，离体雌核发育在葫芦科蔬菜上更是发展迅速，闵子扬等于2016年首次在南瓜上获得单倍体植株，而离体雌核发育技术进一步成为黄瓜单倍体育种最常用的育种手段，已陆续育成新品种‘津美3号、‘津优401和‘津优409。另外，离体雌核发育还被应用于分子遗传图谱的构建和转基因育种研究。众多研究表明，离体雌核发育研究工作的开展对葫芦科蔬菜育种和遗传研究具有重大意义，但是此项研究还处于初级阶段，还存在出胚率低、胚质量差等诸多问题。基于此，笔者对影响葫芦科蔬菜离体雌核发育诱导的影响因素进行分析和总结，以期为葫芦科蔬菜离体雌核发育研究工作的开展提供参考。

1影响离体雌核发育的主要因素

1.1基因型

大量研究表明离体雌核发育和离体雄核发育一样具有明显的基因依赖性，供体植株的基因型不仅影响出胚率，还影响胚的质量。在同等诱导条件下，不同基因型材料其诱导率和出胚率有极显著差异，特定的基因型只对特定的培养基有反应。荣文娟等以8个不同基因型西瓜品种为材料进行未受精胚珠培养，其胚珠启动率差异较大，从57.2%到92.3%不等。刘立功等进行黄瓜离体雌核发育研究，发现7个品种都能诱导出胚状体，但其出胚率最高可达25.3%，最低只有0.7%。闵子扬等对6个南瓜品种进行了未受精子房离体培养，其中5个品种可以诱导出胚状体，但出胚率有较大差异，另外1个品种不能诱导出胚。

1.2取样时期和取样部位

取样时期关系到胚珠中胚囊细胞的发育程度，而胚囊发育时期对离体雌核发育胚状体的诱导有着极其重要的影响。不同种类作物适合进行离体雌核发育诱导的取样时期不尽相同，在葫芦科作物中以接近成熟或成熟的胚囊细胞效果最好。谢冰等认为开花当天的西葫芦未受精胚珠的活力较高最有利于离体雌核发育。孙守如等、陈玲、闵子扬等均认为开花当天南瓜雌花进行离体雌核诱导其出胚率最高，且孙守如等认为开花当天的外植体诱导形成愈伤组织少且不易褐化。另外，Li等以甜瓜为研究材料得到了相同结果。Gemes-Juhfisz等研究黄瓜离体雌核发育则发现雌花开放前6h的胚囊刚好成熟，此时胚的诱导率最高，而杜胜利、Diao等则认为开花前2～3d的黄瓜未受精子房的胚诱导率最高。

此外，子房的发育情况也影响雌核发育的诱导。赵晓菲和刘立功等研究了取样部位对离体雌核发育的影响，结果表明，采收于相对中间的节位的未受精子房有利于诱导雌核发育，子房采收部位过高或过低都不利于胚状体诱导。在黄瓜未授粉子房培养研究中发现，取自第21～第30节位的子房诱导时出胚率最高，节位往上出胚率降低。

1.3培养基

1.3.1基本培养 基基本培养基对离体雌核发育胚状体诱导率有一定的影响，从研究报道来看，葫芦科作物大部分使用MS作为基本培养基进行离体雌核发育诱导。谢冰以西葫芦为试材研究了MS、N6、B5、Miller 4种培养基对离体雌核发育的影响，发现MS和N6培养基的诱导效果较好。程慧等同样以西葫芦未受精子房為材料比较MS、B5、N6和White 4种培养基并得到了相同的结果，其研究表明MS基本培养基更有利于诱导胚状体，胚状体诱导率达16.67%，N6培养基次之，胚状体诱导率为13.33%。在黄瓜未受精子房培养中也有使用CBM培养基和改良培养基。

1.3.2外源激素 前人研究表明，培养基中外源激素的种类和浓度配比对雌核发育的诱导有着极其重要的影响，但是不同作物甚至不同品种所适用的激素种类和浓度不同。在葫芦科离体雌核发育研究中2，4-D、NAA、6-BA、TDZ等被广泛应用。以西葫芦为试材，赵晓菲研究发现MS+0.1mg·L^-1NAA+2.0mg·L^-16-BA培养基能有效诱导不定芽，而葛志东的试验中以3.0mg·L^-12，4-D+0.25mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA效果最好。以南瓜为试材，孙守如等认为最佳诱导培养基为MS+1.0mg·L^-12，4-D+0.25mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-16-BA，其出胚率高达31.1%，而闵子扬等则认为添加0.06mg·L^-1TDZ时诱导可直接出胚，操作上更简洁方便。以黄瓜为试材，裴晓利、LI等、E.Moqbeli等研究了TDZ对离体雌核发育的影响，并一致认为TDZ有利于胚状体的诱导。裴晓利的试验结果表明，培养基中添加0.06mg·L^-1或0.08mg·L^-1TDZ有利于黄瓜胚状体诱导，诱导率高达92.00%和93.10%。E.Moqbeli等则认为添加0.04mg·L^-1TDZ效果较好。LI等认为添加0.03～0.07mg·L^-1的TDZ均有利于黄瓜离体雌核发育诱导，但是不同品种的最适TDZ浓度不一样。另外，TDZ也有利于甜瓜和西瓜离体雌核发育。荣文娟等曾报道TDZ较2，4-D和KT更有利于促进西瓜雌核发育，在培养基中添加0.05mg·L^-1TDZ+2.0mg·L^-16-BA+3mg·L^-1NAA时愈伤诱导率最高。另外，TDZ和NAA结合使用有利于胚状体诱导和生根成苗，以0.05mg·L^-1TDZ+0.25mg·L^-1NAA效果最好。endprint

除此之外，IAA、IBA和NAA等激素多被用于再生植株的生根培养，KoLI等在进行甜瓜未受精胚珠培养时对IAA、IBA、NAA3种激素对再生植株生根的影响进行了比较，发现在相同浓度下IAA比IBA和NAA更有利于再生植株生根。近年来，GA也被用于离体雌核发育研究，有报道在再生培养基中添加0.4-0.8mg·L^-1的GA时可有效打破再生植株“花打顶”现象从而提高植株再生率，且GA有利于再生植株生根，使根系粗且长。

1.3.3蔗糖 陈学军等认为碳源影响着培养基的渗透压，而雌核发育需要在较低的渗透压中进行。在前人研究中，葫芦科离体雌核发育的培养基中多添加30g·L^-1蔗糖。谢冰等、Shalaby等都曾研究蔗糖浓度对雌核发育诱导的影响，谢冰等人的研究表明，在MS培养基中分别添加10、20、30、40g·L^-1蔗糖时，添加30g·L^-1蔗糖的培养基出胚最多，Shalaby等人则是在培养基中分别添加了30、60、90g·L^-1蔗糖，发现添加30g·L^-1蔗糖时胚珠启动率最高，90g·L^-1时胚珠几乎不发育。另外，蔗糖浓度对胚状体成苗有一定影响，在培养基中添加20g·L^-1蔗糖时胚状体成苗率最高，西葫芦再生植株生长健壮，较易驯化、移栽。

1.3.4附加成分 通常培养基中也会添加少量附加成分，如抗坏血酸（Vc）、活性炭（AC）、硝酸银（AgNO₃）、各种氨基酸等等。Vc、AC、和AgNO₃都是常见的抗氧化剂和吸附剂，可以有效减轻外植体的褐化，有利于离体雌核发育诱导和植株的再生。另外，陈学军等认为高浓度的NO_3-有利于不定芽的产生，刁卫平等、裴晓利、LI等的试验均证明硝酸银有利于黄瓜离体雌核发育。并且，刁卫平等人认为，硝酸银可以提高胚发生率，同时能缩短胚出现的时间并提高胚的产量，最佳添加量为20mg·L^-1。

1.4预处理

预处理方式对离体雌核发育诱导有着极其重要的影响。预处理主要有黑暗热激和低温处理2种途径。一般认为预处理改变了细胞的生理状态，影响其分裂方式和分化方向，但是不同基因型对温度的敏感度不同，因此最佳处理温度和时间也不一样。多项研究表明适当的热激处理可以激发雌核发育的启动，缩短胚状体的诱导时间。35℃热激在试验中应用较多，G6mes-Juhtlsz等、E.Moqbeli等、Pivada等的研究均表明，热激有利于黄瓜离体雌核发育，并认为在35℃条件下热激2～4d时诱导率和植株再生率最高，孙守如等、陈玲㈣、葛志东则认为热激处理5d效果最好。然而，王璐等认为25℃比35℃更适合黄瓜离体雌核发育的启动，这可能与供体材料基因型不同有关，牛明明也认为30℃较35℃更有利于甜瓜雌核发育诱导。

低温预处理的诱导效果随外植体不同而不同，Metwally等认为4℃低温预培养不利于南瓜离体雌核诱导，但是有利于甜瓜离体雌核诱导。Malik等也认为低温预处理（4℃）4d可以有效提高甜瓜出胚率。而荣文娟等㈣的试验结果表明在进行西瓜雌核诱导时4℃处理没有明显效果，且其对胚珠反应率和愈伤诱导率的影响随培养基成分不同而变化。

1.5栽培季节

栽培季节影响着离体雌核发育的诱导率和出胚率。陈学军等、赵晓菲曾报道不同播期的西葫芦雌核发育诱导率存在极显著差异，以秋播的诱导率最高，夏季次之，春季栽培诱导率最低。陈学军等人认为，这可能与日照长度有关，西葫芦是短日照植物，秋播时短日照条件刺激了雌核发育相关基因的表达。魏爱民等的研究也表明，温度较高且阳光充足时黄瓜未受精子房的出胚率和成苗率明显高于其他季节，并且塑料大棚内的供体植株比露地植株污染率低且更容易诱导单倍体。

1.6接种方式

子房或胚珠不同的消毒方式和切割方式对胚状体的诱导也有一定影响。陈玲、闵子扬等有报道，先切片再消毒比先消毒再切片更有利于南瓜未受精子房进行离体雌核诱导。陈学军等和陈玲比较了横切、纵切、切啄、完整胚珠4种方式对胚状体诱导率的影响，均认为横切最有利于离体雌核发育的诱导，愈伤诱导率最高达28%。

2再生植株的驯化移栽

再生植株的苗龄、质量、驯化方式、移栽时的温度和基质对再生植株的成活率都有不同程度的影响。谢冰等在研究的基础上提出了“循序渐进”原则，让组培苗逐渐适应出瓶后的环境，即在西葫芦再生植株长至7～8片叶时置于昼温22～28℃、夜温12～18℃条件下，进行先闭瓶再开瓶逐步驯化，当移栽基质为V_蛭石：V_草炭为1：1时成活率最高，可达95.0%以上。赵晓菲等在再生植株具有5～6片真叶时驯化移栽，成活率也高达90.0%。

3再生植株倍性鉴定

离体雌核培养的再生植株理论上起源于胚囊成员细胞，所以再生植株应该是单倍体和自然加倍的双单倍体，但也有可能是由珠心、珠被等体细胞发育而成的二倍体，因此再生植株倍性的鉴定是后续利用的基础。植株鉴定的方法早有报道，主要有染色体计数法、流式细胞测定法、叶片保卫细胞叶绿体计数法、杂交鉴定法、同工酶鉴定法和形态学鉴定法等。杜胜利曾以黄瓜离体雌核培养的再生植株为材料研究和比较了几种不同的倍性鉴定方法，发现最有效最直接的鉴定方法是体细胞染色体计数法，试验结果更为准确可靠。不同倍性植株的叶片保卫细胞叶绿体个数、染色体中心直径和异染色体数目都不一样，可以间接鉴定黄瓜再生植株的倍性。另外，也可以根据不同倍性植株的长势、花冠形态、花粉粒及结籽的差异来辅助判断再生植株倍性。目前倍性鉴定应用最多的是染色体计数法和流式细胞仪检测，但是二倍体再生植株就必须应用分子标记等技术鉴定其纯合性。不过我们也可以对再生植株自交后代进行整齐度试验，这样不仅可以确定再生植株纯合性，同时还可以调查记录其农艺性状。

4问题与展望

利用离体雌核发育技术进行单倍体育种已经成功地在黄瓜上進行了实践，天津科润黄瓜研究所将离体雌核发育技术与常规育种结合，成功培育出了新一代长势强、分支少、抗病性强、丰产性好的黄瓜品种，其利用单倍体技术创制黄瓜育种新材料研究达到了国际先进水平。与离体雄核发育相比离体雌核发育具有许多优势，通过离体雌核发育产生的再生植株白化苗比例低，并且能够从雄性不育植株或雌株中培育出单倍体植株。但是现今阶段离体雌核发育诱导单倍体技术还存在许多问题，如出胚率低、重复性差、再生植株玻璃化严重、畸形率高、倍性鉴定难度高等。离体雌核发育基因依赖性很强，有些品种的出胚率很低，甚至无法诱导出胚。另外，离体雌核发育诱导过程受其他如植株生长环境、胚囊发育时期、激素水平等多种因素的影响，因此其重复性不高，很难进行规模化育种材料创制。此外，再生植株培养过程中玻璃化严重和畸形率高造成再生植株成活率低，是离体雌核发育应用于育种实践的又一大障碍。为提高试管苗成活率，胡芳芳等对诱导培养基进行了筛选，并优化了植株培养条件，降低了玻璃化程度，但是最高成活率也仅有46.67%。

虽然葫芦科植物离体雌核发育技术已经取得一些进展，但单倍体诱导率和植株成活率仍然很低，仍然无法满足育种实践的需要，所以如何建立高效、稳定的植株再生体系是我们亟待解决的问题。另外，深入研究离体雌核发育机制也是提高单倍体育种技术效率的关键。通过离体雌核发育技术创制大量育种新材料，然后利用分子标记辅助选择可进一步提高育种效率。所以，打破基因型依赖，建立高效、可重复的培养体系，探索更为简单、有效的倍性鉴定方法，与常规育种和分子标记辅助育种紧密结合，对雌核发育进行深层次研究是我们科研工作者的努力方向。endprint