肿瘤药物基因组学研究平台的发展和应用

赵建华， 唐金海

目前肿瘤的药物治疗仍主要依据各种用药指南和医生的临床经验。同样病症的不同患者使用相同的药物后常表现出明显的疗效差异，副作用亦千差万别，这一直是困扰临床用药并影响肿瘤治愈率的重大问题。随着分子生物学技术和人类基因组研究的飞速发展，人们期望药物基因组学的应用能真正崛起解决这一难题。

药物基因组学(pharmacogenomics)是在药物遗传学基础上发展起来的，主要研究遗传因素对药物代谢和反应的影响，确定药物作用的靶点，研究从表型到基因型的药物反应的个体多样性。他的实施有赖于遗传差异的快速鉴定及其广泛、高效的检测分析[1]。目前，基因检测技术的发展已经给鉴定遗传变异对药物作用的影响提供了前提条件；高通量筛选系统及生物信息学等的发展，为药物基因组学研究提供了高效的思路和手段。本文主要就药物基因组学研究策略及其技术平台的发展进行简要概述。

1 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其检测分析

人类是具有遗传多态性的群体，其基因组DNA序列中大约90%的变异形式是单核苷酸多态性。业已证明，编码药物代谢酶、转运蛋白、靶蛋白(受体)和信号传导相关因子等的基因都存在SNP现象，其中位于基因编码区的SNP通常会引起蛋白质氨基酸的变化，导致其活性或功能改变；位于调控区的SNP则可影响基因的表达和调控，也会影响药物代谢和反应[2]。通过检测对特定药物具有敏感性或抵抗性的患者群的SNP差异，可以寻找与药物代谢和反应有关的遗传标记，从遗传背景预测个体的药物反应，指导临床用药。第一个被阐明具有SNP的代谢酶是细胞色素P450(CYP450)酶系中的CYP2D6，编码此酶的基因具有多态性，导致患者对药物呈现快代谢和慢代谢两种不同的代谢方式，慢代谢型患者体内的CYP2D6酶不能很快地分解药物，使其血液中的活性药物浓度升高，提示该基因型个体易产生药物中毒，治疗时应适当减少药物用量[3]。最近，美国FDA要求在伊立替康的药物包装内附上尿苷二磷酸葡萄糖苷酸转移酶(UTG)1A1基因分型信息，推荐以基因型为基础选择药物治疗用量；几项临床前瞻性研究也证实预先基因分型再指导药物剂量选择对减少该药毒性有重要价值，从而推动了药物基因组学向临床应用迈进。目前，已陆续有不少关键通路上的代谢酶或蛋白因子的SNP被鉴定，它们在药物基因组研究中正扮演着重要角色[4]，有待于人们的开发与利用。

关于SNP的检测，目前大多仍以PCR技术为基础，根据识别SNP原理的不同主要分为4种类型：(1)PCR-酶切电泳技术：传统方法有限制性片段长度多态性(RFLP)和随机扩增多态性(RAPD)，该技术虽有利于未知位点的筛查，但因需要PCR后酶切电泳分析，费时费力且难以自动化。近年来随着引物入侵分析技术以及PCR扩增-双重引物入侵分析等方法的引进，SNP检测效率及通量有了明显提高。(2)等位基因特异性杂交技术：包括TaqMan探针、分子信标、动态等位基因特异性杂交以及芯片技术等，其突出的优点是能准确可靠地探测特异等位基因序列，方便快捷且可实时监控；如采用多色荧光标记或利用芯片，则可明显提高检测通量；但要确保准确分型，探针的设计非常关键。(3)引物延伸技术：包括基于碱基序列测定的单重或多重测序法以及基于引物3’端碱基互补性的等位基因特异性延伸法。后者的关键问题是引物的非特异性延伸，后经Ahmadian等[5]通过引入三磷酸酰苷双磷酸酶在错配碱基发生延伸反应前将其降解的方法以及Zhou等[6]采用的引入人工突变碱基的方法，得到了较好的解决。基因芯片结合引物延伸技术是2000年Pastinen等[7]发展的一种SNP检测新策略，具有通用性强和通量高等优势。Hirschorn 等[8]利用该方法测定了100多个SNPs，获得5 000 多个基因型，精确度在99%以上。(4)寡核苷酸连接技术：是在连接酶链式反应原理基础上发展起来的，由耐热DNA连接酶介导的一种等位基因特异性寡核苷酸探针连接反应。利用高温下两条探针的特异性杂交以及连接酶反应的忠实性使分型准确性得以双重保证，尤其是对于重复序列区域多态性的特异检测是其独到的优点[9]。如将该技术与通用芯片技术或色谱技术等相结合，可在保证分型准确性的同时将其检测通量由几个或十几个提高到成百上千个[10]。

2 连锁分析和关联分析

连锁分析和关联分析的原理和假说基本相似，两者均以相邻近的DNA变异共分离为基础。连锁分析是通过鉴定经多代传递仍完整的单倍型为基础的，检测在一个家系中等位基因与疾病的传递是否相关。而关联分析则是在一个群体中或在不相关人群中寻找与性状(疾病或药物反应)相关的染色体区域。在常见的复杂性疾病如肿瘤中，由于每个效应基因的贡献度较小，应用关联分析往往比连锁分析更有效[11]。

1999年Evans等[12]认为药物治疗的综合药理效应是典型的非单基因特性，更确切地说应是几种基因编码蛋白质包括药物代谢、分布及效应的多种途径的相互作用。2000年Rosos[13]提出选择一些与药效及普通不良反应表型相关联的SNP链锁非均衡的小部位就有可能实现快速和廉价地筛分患者对药物疗效和副作用的反应。通常，一个染色体区域可以有很多SNP位点，但只用少数几个标签SNPs,就能够提供该区域内大多数的遗传多态模式，这样将大大减少用于基因型与疾病关联分析中的SNPs[13]。目前，基于SNP的连锁图谱已经开始构建，人们可利用它作为工具对药物体内代谢和转运过程中多个相关基因及其SNPs进行关联分析，且已有一些研究证实，单倍型分析(共同遗传的多态性组合)比单个多态性分析具有更好的表型相关性[9,12]。如Drysdale等[14]利用SNP关联分析进行哮喘病药物基因组学研究，发现β2-肾上腺素受体(β2-AR)基因上13个SNPs所形成的不同单倍型与β2-AR激动剂的治疗反应显著相关，而个体SNPs的影响作用很小。

3 基因表达谱的研究与检测分析

肿瘤的治疗效果不仅与患者本身的遗传背景相关，而且与恶性肿瘤组织的遗传学改变密切相关。肿瘤组织基因表达谱的研究，可以探寻与疾病有关的基因和阐明药物的作用机理，同时还可以确定某差异表达基因是否能够成为药物靶点或直接作为治疗药物(基因药物或蛋白质药物)，如Herceptin(用于治疗乳腺癌)、Erbitux(用于治疗直肠癌)以及Gleevec(imatinib，用于肿瘤治疗)等药品，都是成功的针对患者中某特定基因或蛋白过表达的个体所开发的药物。

基因的表达差异也是药物疗效的基础。如5-氟尿嘧啶(5-FU)的治疗反应除了受二氢嘧啶脱氢酶、胸苷酸合成酶和胸苷酸磷酸化酶等基因的多态性影响外，肿瘤组织异常表达的基因同样也影响其疗效；研究人员通过分析在乳腺癌细胞株中5-FU诱导的基因表达，已经确定了与耐药和疗效有关的基因[15,16]；Szoke等[17]通过分析文献报道的对5-FU耐药的胃癌和结直肠癌的全基因组基因表达谱数据，发现胃癌和结直肠癌中与5-FU 耐药相关的表达谱是一致的，提示不同肿瘤对5-FU可能具有相同的耐药机制。另外，常见的成人或儿童急性白血病的微阵列基因表达分析可以鉴定与特殊染色体易位或删除有关的分子图表类型，用以指导临床进行不同治疗方案的选择[18]。

4 基因组学研究与基因芯片的检测分析

选择与药物起效、活化、排泄等过程相关的候选基因并鉴定其基因序列的变异是药物基因组学研究的首要策略[1]。虽然人类基因组序列图谱对辨认基因起了关键作用，但是人类基因图谱还没有完全弄清遗传方面的差异，而这种差异即SNP与疾病、临床诊断和药物反应差异等密切相关。为了能寻找出个体差异的内因，科学家制订了一项绘制新型基因图谱，从生命本源追溯人与人之间的差异，探索疾病之源的计划——人类基因组单体型图计划(Hap Map)[2]。随着Hap Map计划的完成，引起诸如癌症、心脏病、糖尿病和精神分裂症等疾病的基因将会被确认和研究，利用这些信息或知识药物基因组学研究可以发现新的治疗靶点和干预以及阐明测定特定药物治疗的药效和毒性的基因群集。

基因芯片(gene chip)的开发和应用可以加快这一进程，即加速与疾病或药物相关基因或信号传递路径的发现和鉴定。以前，药物基因组研究多局限于某一个或几个基因及其多态性与药物反应的关系，无法全面认识药物作用过程中各相关基因所承担的作用和复杂的相互调控关系；而基因芯片技术可同时检测几千，甚至几万个基因的变异或差异表达状态，并分析它们之间的相互作用关系，为药物基因组学研究提供了重要工具[19]。随着技术的成熟，基因芯片在药物基因组学研究中的应用也逐步深入，归纳起来包括：(1)他可以为DNA序列变异体建立“标签”，利用这些标签可根据疾病易感性和药物反应的遗传学亚型将患者分类，优化临床药物治疗。(2)他可以用来筛选药物作用的靶基因。选择合适的药物作用的靶细胞，以不同的药物剂量和不同的药物作用时间，确定药物作用于靶细胞后与基因表达水平改变之间的量效和时效关系，然后获取药物在一定浓度、一定时间条件下作用的细胞和未经处理的细胞，于同样条件下进行表达谱基因芯片的检测，最终确定药物所作用的基因靶点，促进新药的开发和利用。(3)基因芯片还可以高通量检测基因的表达，确定患者基因组中出现的多态性和肿瘤组织的遗传学变异；如果利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异，还能从基因水平解释药物的作用机制[19]。

基因芯片技术的发展很快，已由十年前的固定式寡核苷酸探针“线性阵列”发展为高密度寡核苷酸微阵列技术，密度现已可达到40万种探针/芯片，如与多元PCR反应结合，还能同步检测在单一等位基因特异杂交反应中是否存在SNPs、插入和敲除、基因转换、完整基因删除与基因复制事件。目前，阻碍基因芯片在临床常规应用的原因，除了技术难度较高和成本昂贵以外，最重要的问题是如何实现检测的标准化。在基因芯片领域已存在多种微阵列技术平台如基于杂交、引物延伸或连接反应等的芯片，使用不同系列的基因以及不同的杂交信号和检测方法，以致于为同一目的进行的研究常常会得到不同的结果，无法进行最终判断。基因芯片检测的标准化已迫在眉睫。

5 蛋白组学研究与蛋白质芯片的检测分析

如何准确地定义临床药物效应的表型并将其与基因型关联起来用于指导药物治疗，是药物基因组学研究的主要策略[1]。由于蛋白表达与基因的关系为非线性关系以及药物作用大多是在蛋白质水平上进行的，因此从基因和蛋白质水平互补地阐明遗传多态性与药物疗效、毒副作用之间的相互关系非常必要。蛋白质组学研究的互补价值主要体现在：(1)有些基因的突变为沉默突变，与基因产物的功能无关；(2)在相当情况下某一基因的SNPs数量太多，相比较分析每一种遗传变异而言，对基因功能产物蛋白质进行分析更为便捷；(3)从基因-mRNA-蛋白质所构成的遗传信息传递的流程图来看，什么情况下有什么样的蛋白质不仅取决于基因，还与细胞信号传导能力、机体所处的周围环境及机体本身的生理状况有关；(4)生物体内蛋白质功能的发挥和相互作用亦存在类似于mRNA分子内的剪切、拼接等自身特有的规律，这种自主性不能从基因的编码序列中预测，只能通过对其表达产物蛋白质进行分析[20]。因此，以蛋白质组学为平台的药物效应评估也应该同样被重视。

蛋白质芯片技术(Protein Chip)是继基因芯片之后发展起来的研究蛋白质组学的有力工具。目前主要有二种类型：一类是蛋白质检测芯片，类似于较早出现的基因芯片，将成千上万种蛋白质如抗原、抗体、受体或酶等在固相载体表面高度密集排列构成探针蛋白点阵，然后依据蛋白质分子间或蛋白质与核酸间相互作用的原理与样品杂交，实现高通量的检测和分析；第二类是蛋白质功能芯片，其本质就是微型化凝胶电泳板，样品中的待测蛋白在电场作用下通过芯片上的微孔道进行分离，然后经喷射进入质谱仪中对待测蛋白质进行功能分析。

6 生物信息学的研究

生物信息学(bioinformatics)是随着基因组计划的启动而兴起的一门计算机、数学、信息技术与生物医学交叉结合的新兴学科，通过对生物学实验数据的获取、加工、贮存、检索与分析等，进而揭示数据所蕴涵的生物学意义。该学科的初期阶段包括核酸序列和蛋白质序列的分析和数据管理、寻找调控区、对序列结构作出预测等。随着人类基因组和模式生物基因组测序计划的实施，又包括了基因组信息的获取、处理、分析和解释，对蛋白质进行功能和定位分类及相关软件的开发和应用，以及高通量药物筛选及其数据的信息处理与分析等[20]。

生物信息学几乎是所有生物(医药)研究开发所必需的工具；只有根据生物信息学对大量数据资料进行分析后,才能选择该领域正确的研发方向。如在人类基因组中，估计有300万～1 000万个SNPs。对于如此巨大的数目，用生物信息学手段和计算机学自动识别方法相结合，并充分利用DNA信息数据库，才能够简便、有效、价廉地发掘出具有应用价值的SNPs，用于药物基因组学研究。

总之，药物基因组学作为新兴的人类基因组学的分支学科,研究所用的方法和技术牵涉较广而且许多技术属于人类基因组学的前沿研究课题,如高通量SNPs检测、DNA微阵列技术和蛋白芯片等正在不断发展之中。可以预料,随着高通量、高灵敏度和特异性的研究方法和技术平台的成熟和标准化，药物基因组学将能为特定人群设计最为有效的药物,为每一个患者设计最为理想的用药方案,不仅可以提高疗效,缩短疗程,而且可以减少毒副作用，降低医药费用，真正实现个体化治疗。

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