组织工程化脉管组织构建的研究进展

戴婷婷 李圣利

·综述·

组织工程化脉管组织构建的研究进展

戴婷婷 李圣利

1 引言

脉管系统包括心血管和淋巴系统两部分，脉管移植是临床用来治疗脉管系统疾病的手段之一。自体血管和淋巴管是较理想的脉管移植物，但是人体自身可供移植的非必需脉管的来源有限，而异体脉管移植存在免疫排斥等问题，因此寻找新的治疗方法和移植材料成为重要的研究课题，脉管组织工程学研究成为热点。脉管组织工程是利用种子细胞和可降解生物支架材料来构建脉管的科学，主要包括：种子细胞、支架材料和生物反应器的应用。现就脉管组织工程的研究进展综述如下。

2 种子细胞

2.1 自体脉管壁细胞

脉管内皮细胞（Endothelial cells，ECs）和平滑肌细胞（Smooth muscle cells，SMCs）是脉管组织工程主要的种子细胞。自体的血管内皮细胞（Blood endothelial cells，BECs）和SMCs无免疫原性，无伦理学争议，是首选来源。1986年，Weinberg等[1]首次应用体外培养的牛主动脉的ECs、SMCs以及外膜的成纤维细胞构建组织工程化血管。国内刘阳等[2]运用犬动脉和人脐静脉的内皮细胞和平滑肌细胞做了相似的实验研究。目前自体血管壁细胞已经广泛应用于组织工程化血管的构建，但是其增殖能力有限，而且在体外培养过程中易出现老化。异体的BECs和SMCs是另一细胞来源，可是免疫排斥的问题仍然无法解决。迄今为止，细胞增殖的难题仍未得到有效解决，所以需寻找可替代血管壁来源的另一种子细胞来源。同BECs一样，自体淋巴管来源的淋巴管内皮细胞（Lymphatic endothelial cells，LECs）同样也是淋巴管组织工程种子细胞的最佳选择。1984年，Johnston等[3]首次利用牛的肠系膜淋巴管成功地分离培养出了LECs。Kriehuber等[4]通过机械挤压真皮的方法来获得内皮细胞，但是收获的细胞较少。Hirakawa等[5]通过CD34阴性分选与CD31阳性分选的方法来获得LECs，虽然在一定程度上提高了细胞的获取量，但是仍然无法达到组织工程对于种子细胞的需要量。近年来，蒋朝华等[6]采用中性蛋白酶和胶原酶消化结合免疫磁珠分选，能够从幼儿包皮组织中获取LECs，同时还证实了冻存的内皮细胞复苏后无明显形态学改变，并保持了较高的活力及体外增殖能力，使淋巴管组织工程种子细胞的来源问题有望得到解决。

自体脉管壁细胞作为种子细胞虽然已经成功应用于组织工程，但是细胞的来源及扩增后的数量仍然很有限，所以需要寻找新的种子细胞来源。

2.2 干细胞

干细胞是一类具有多向分化潜能的未分化的原始细胞，在体外大量增殖不易老化，成为近年来组织工程研究关注的热点。根据其发育阶段不同，可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。

2.2.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES）是一类源于早期胚胎或原始生殖细胞等组织的多能干细胞，具有持续增殖而保持不分化的能力，经诱导后可分化为成熟个体中几乎所有类型的细胞。沈干等[7]用兔动脉来源的SMCs和ES来源的内皮细胞构建出完整的血管组织。Levenberg等[8]证实人类胚胎干细胞可以分化为BECs，同时在基质胶原上形成管样结构，移植入重度联合免疫缺陷（SCID）鼠的体内后可以形成微血管。以上结果均证实了ES细胞可作为组织工程化血管的种子细胞使用。此外，Sabin[9]通过对猪胚胎发育的研究发现，淋巴管系统在发育过程中与血管系统相互连通，因此ES细胞同样也有可能成为组织工程化淋巴管的种子细胞。但是，目前相关的伦理问题限制了其应用。

2.2.2 成体干细胞

成体干细胞（Adult stem cells，ASCs）通常是指分布在成年动物和人体组织中具有构建和补充某种组织细胞功能的干细胞。

内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是成体干细胞的一种，为内皮细胞的前体细胞，具有增殖、迁移和分化为成熟的内皮细胞的能力。已有研究表明，EPCs能够分化为成熟的BECs，并且扩增20代以上仍维持其分化潜能[10]。Kaushal等[11]将EPCs作为种子细胞种植到猪髂动脉的脱细胞血管支架上，修复羊的颈动脉缺损，130 d后血管仍保持通畅。以上结果表明，EPCs与BECs功能相似，可以成为血管组织工程的种子细胞来源。而Salyen等[12]也发现，胚肝中存在CD34+/CD133+/VEGFR-3+的EPCs，这些细胞经体外诱导，可以分化为表达LECs特异性标志物的细胞，提示了EPCs作为淋巴管组织工程的种子细胞来源的可能性。

骨髓基质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓中一种定向干细胞，也属于ASCs的一种，在体外具有分化为血管平滑肌的能力。Cho等[13]利用犬骨髓来源的BECs和SMCs成功构建了小口径的组织工程化血管，移植入犬颈动脉，保持通畅达8周。此外，Hibino、Shin′oka和Mastumura等[14-17]已经成功地在犬模型和病人体内用BMSCs修复了血管缺损。以上研究证实BMSCs能够成为脉管组织工程的种子细胞来源之一。

近年研究发现，脂肪基质中存在具有多向分化潜能的干细胞，即脂肪干细胞（Adipose derived stem cells，ADSCs），其来源广泛，是新的种子细胞来源。Zuk等[18]从脂肪组织中分离出ADSCs，并发现其能够分化为肌细胞；Martinez-Estrada等[19]在体外三维培养条件下从脂肪组织中分离出Flk+的血管内皮前体细胞群，此群细胞能够分化为成熟的BECs。因此，ADSCs有望成为脉管组织工程新的种子细胞来源。

总之，干细胞作为新的种子细胞的引入，为组织工程种子细胞来源问题的解决带来了新的希望。

3 支架材料

脉管组织工程支架材料主要是为种子细胞提供生长空间和必要的力学支撑。各种不同的材料已经用于血管组织工程，包括天然生物材料和人工合成生物材料。虽然淋巴管组织工程支架材料的相关文献未见报道，但是以发育生物学而言，淋巴管的形成在血管形成之后，淋巴管系统和血管系统相互依赖，它们在结构和功能方面存在相似性和相近性，在支架材料领域很大程度上可以互相借鉴，因此用来构建血管的生物材料同样可以尝试成为构建淋巴管的支架。

3.1 天然生物材料

天然生物材料主要包括来源于天然生物体的大分子无结构材料（如胶原、弹性蛋白等），以及脱细胞及部分基质成分的结构性材料（如脱细胞血管基质等）。胶原和弹性蛋白是血管壁的主要成分，含有细胞黏附域序列，具有良好的细胞相容性。早在1986年Weinberg等[1]就用胶原凝胶首次成功构建了组织工程血管。可是，由于胶原等天然生物材料力学强度较差，构建的血管远不能达到正常血管的生物力学性能。而脱细胞基质类生物材料完全由天然的细胞外基质构成，可以用来维持血管的力学特性，同种异体脱细胞血管已经用来成功修复了犬股动脉和颈总动脉[20]。

3.2 人工合成生物材料

与天然生物材料相比，人工合成的材料可以调控其分子量、亲水性和降解速率。人工合成的材料主要分为不可降解和可降解材料两种，血管组织工程目前应用的多为可降解人工合成材料（如PGA、PLA等）。Niklason等[21]应用PGA支架成功构建了组织工程化血管，但是由于其降解速度太快，导致构建的血管移植物的生物力学性能下降。因此，可以在制作PGA支架时加入降解速度相对较慢的人工合成的聚合物，以此来提高移植物的生物力学强度。此外，通过理化方法对人工合成材料的表面进行修饰改性，可以提高支架的生物相容性。Gao等[22]应用NaOH将PGA纤维表面处理后，血管SMCs的黏附提高到未处理前的2倍。近年来，随着电纺丝、纳米材料等新技术的出现，人工合成材料的性能得到较大改进，从而使得材料结构更加符合构建的需要。

4 生物反应器的应用

天然的脉管在机体内一直处于流体动力学环境中，即管壁始终承受着液体层流产生的切应力，其对管壁细胞的形态、增殖以及细胞外基质的合成与分布都有重要影响。为了提高构建的脉管的生物力学性能，需要模拟脉管的生理环境和力学环境。Niklason等[21]首先利用生物反应器模拟体内血流动力学环境，构建了具有一定生物力学性能的组织工程化血管。Williams等[23]也在生物反应器灌注条件下构建组织工程化血管，并且证实了随着培养时间的延长，可以提高该血管的生物力学性能。而淋巴管和血管在体内的生理环境基本相同，承受的切应力只是程度上有所差异，因此淋巴管的构建环境完全可以借鉴血管组织工程构建环境方面的相关研究成果。然而，目前生物反应器的力学参数无法模仿胚胎发育脉管系统形成的变化规律，影响了远期通畅率，因此，寻找生物反应器的最佳参数值是目前研究的热点和难点问题。

5 存在问题与展望

近年来，血管组织工程发展迅速，取得了很大的进步，但也仍然存在很多问题和挑战。种子细胞来源问题一直是血管组织工程亟待解决的难点，虽然BECs和SMCs的分离培养技术已渐趋成熟，但是细胞体外扩增易老化问题仍需克服。干细胞的运用，解决了种子细胞来源少的问题，可是其定向分化及培养的机制尚未完全明确，限制了其应用。

随着材料学技术的日益精进，支架材料的特性逐渐接近正常的血管壁组织，但是其应用于人体是否存在风险性仍需要长期研究予以佐证，同时血管移植物远期通畅率及抗血栓形成能力也需要给予长期的关注。生物反应器的引入不仅增强了血管壁的机械强度，同时远期通畅率和抗血栓形成能力也有了较大的提高。

应用组织工程技术构建淋巴管相关文献尚未见报道。近年来，随着对LEC特有分子标志和分子特性的逐渐明晰，其分离纯化和鉴定技术也得到了很大的发展[24-28]。同时，随着构建淋巴管必需的种子细胞来源问题逐步得到解决，以及血管组织工程支架材料和构建环境领域获得的成功也为淋巴管组织工程提供了重要的参考，使得淋巴管构建成为可能。淋巴管和血管诸多相似性的存在，使得两个领域可以相互借鉴。由于淋巴管相对于血管解剖结构的特殊性，利用组织工程技术构建淋巴管更具有挑战性。如何在保持LECs具有足够活性的前提下获得相当数量的种子细胞，以及LECs和支架材料的相容性问题和结合的最适条件等诸多问题仍然亟待研究和解决。

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Q813.1+2

B

1673－0364（2009）－02－0108－03

2008年12月11日；

2009年1月19日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.016

上海市教育委员会科研重点项目（07ZZ41）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。