雷公藤甲素对子宫内膜癌细胞株HHUA体外抑制作用的研究

蔡 玉， 孙志华， 吴 强， 仲 剑

中药雷公藤用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾炎等免疫性疾病已有上千年历史。近年来文献报道其提取物雷公藤甲素对多种肿瘤细胞有明显的细胞毒活性，并可诱导肿瘤细胞凋亡，具有广谱抗肿瘤效应，在肿瘤治疗方面的应用日益受到

人们的关注。但在其对人子宫内膜癌HHUA细胞株的作用的研究方面，国内外尚未见相关报道。故本研究主要观察雷公藤甲素对体外培养的人类子宫内膜癌HHUA细胞株生长增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人子宫内膜腺癌细胞株HHUA受赠于山东大学山东省立医院，雷公藤甲素购自中国药品生物制品检定所，纯度≥98%，用二甲基亚砜(DMSO)配制成1 g/L储备液，0.22 μm的滤器过滤除菌，-20℃保存，临用前用无血清培养液稀释成所需浓度；试剂分别购自相关公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)和DMSO 购于Amersco公司，细胞培养基1640购于Hyclone公司，胎牛血清购于杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HHUA细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的1640培养液中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。每3天传代1次,细胞呈单层贴壁生长。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力 取2×104/mL的HHUA细胞接种于96孔培养板，每孔100 μL，置37℃ ，5%CO2培养箱中培养24 h，更换培养液后加上各种浓度的雷公藤甲素，继续培养24、48、72 h。终止培养前加MTT(5 g/L)，每孔20 μL，37℃再培养4 h，吸出上清液,加 DMSO 150 μL/孔，振荡至紫色结晶完全消失，然后在酶标仪上490 nm处测定吸光度值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组A值-空白对照孔A值)/(阴性对照组A值-空白对照孔A值)]×100%。

1.2.3 流式细胞仪测定细胞周期与凋亡样本的处理 以雷公藤甲素(10、20、40、80、160 ng/mL)处理HHUA细胞，同时用培养液和相应浓度的DMSO作对照组，培养48 h后终止实验，收集细胞，PBS洗涤2次，4℃、体积分数为75%的乙醇固定过夜。PBS洗涤2次，碘化丙啶(PI)染色，4℃避光30 min后上机检测，计算各期细胞所占比例，G1峰前面出现的亚2倍体峰即为凋亡细胞峰。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 雷公藤甲素对子宫内膜癌HHUA细胞增殖的抑制作用

不同浓度雷公藤甲素对HHUA细胞作用24、48、72 h的增殖抑制率。雷公藤甲素对HHUA细胞的生长抑制作用呈剂量时间依赖性。实验组与对照组进行比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。24 h、48 h 及72 h的IC50值分别为177.0 ng/mL、93.2 ng/mL、43.4 ng/mL(图1)。

图1 雷公藤甲素对人子宫内膜癌HHUA细胞增殖抑制作用

2.2 流式细胞仪检测雷公藤甲素对HHUA细胞周期分布的影响

不同浓度雷公藤甲素作用于肿瘤细胞48 h后，与对照组相比，随着药物浓度的增加，在S期的细胞比例逐渐增大，其中40 ng/mL组和80 ng/mL 组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 流式细胞仪分析雷公藤甲素对HHUA细胞周期分布的影响

*与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)

2.3 流式细胞仪检测雷公藤甲素对HHUA细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示：未经雷公藤甲素处理的HHUA细胞无明显凋亡峰。而经雷公藤甲素(40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL)处理48 h后，在G1期前出现明显的凋亡峰，细胞凋亡率分别为16.01%、17.05%、63.85%(图2)。

A：未处理对照细胞；B～D：雷公藤甲素(40、80、160 ng/mL)处理48 h细胞图2 流式细胞仪分析雷公藤甲素对HHUA细胞凋亡的影响

3 讨论

子宫内膜癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%。在过去的20～30年里，由于生活水平的提高及不当的激素替代治疗等原因，子宫内膜癌的发病率呈明显上升趋势[1]。雷公藤甲素是一种从雷公藤中提取到的主要活性物质，系一种环氧二萜单体成分。近年来，大量的体内外实验研究表明雷公藤甲素对如白血病、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤有抑制作用[2-7]，但用于子宫内膜癌治疗方面的研究尚不多见。本实验研究雷公藤甲素对人子宫内膜癌细胞株HHUA的作用，探讨临床应用雷公藤甲素治疗子宫内膜癌的可行性。

本实验观察了不同浓度的雷公藤甲素对人子宫内膜癌细胞株HHUA的生长抑制情况，并与未经雷公藤甲素处理的对照组进行对比。发现雷公藤甲素对HHUA细胞的生长有明显抑制作用，并且在一定的浓度范围内随药物浓度和作用时间的延长，抑制作用也显著增加。作用72 h时，5 ng/mL雷公藤甲素即可抑制HHUA细胞的增殖；随着浓度的增加，雷公藤甲素对细胞的抑制作用呈线性增长。这与雷公藤甲素抑制多种肿瘤细胞的作用一致[2-5]。雷公藤甲素作用24、48、72 h的IC50值分别为177.0 ng/mL、93.2 ng/mL和43.4 ng/mL，提示临床应用可采用减小剂量并延长用药时间的方法达到抑制肿瘤细胞增殖的作用，并可减少药物的毒副反应。

细胞凋亡在肿瘤的发生机制中具有重要的意义，是细胞在一定的病理或生理条件下，由基因调控的主动而有序的自我消亡过程，是一种不同于细胞坏死的细胞死亡形式。以往研究证实，肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞失控性增殖和凋亡减少有关，抗肿瘤药物可以通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤生长。雷公藤甲素(40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL)处理HHUA细胞48 h后，在G1期前出现明显的凋亡峰，细胞凋亡率分别为16.01%、17.05%、63.85%，具有剂量依赖性。并且，随着药物浓度增加，S期细胞增多，G2/M期细胞减少，40 ng/mL及80 ng/mL的雷公藤甲素将HHUA细胞周期阻滞在S期，这与其他作者的相关研究一致[3-4]。倒置显微镜下可见随着药物剂量的增加，死亡的变圆漂浮的细胞亦逐渐增多。以上数据表明雷公藤甲素可能通过干扰细胞周期，诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞的生长。

本研究显示，雷公藤甲素对人子宫内膜癌HHUA细胞的生长有抑制作用，其作用机制表现为阻滞肿瘤细胞于DNA合成期，并导致一定数量的细胞凋亡。雷公藤甲素通过何种途径诱导HHUA细胞凋亡将是下一步的研究方向。通过体内实验，建立动物模型，进一步研究雷公藤甲素的抗肿瘤作用及毒副作用，为其临床应用打下一定基础。

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