应用ＲＴ－ＰＣＲ分子检测技术快速检测大蒜普通潜隐病毒

张　威　张匀华　李学湛　高艳玲　白艳菊

摘要：根据大蒜普通潜隐病毒(Gdrlic common latent virus，GCLV)的外壳蛋白区域的保守序列设计合成一对寡核苷酸引物，以带毒植物的总RNA为模板，进行反转录和PCR扩增，通过反应体系和反应程序的建立与优化，扩增得到长300 bp的目的片段，并将目的片段转入大肠杆菌进行了克隆和序列测定。测序结果与GenBank中其他GCLV相应区域的序列同源性最高达98％。并对其检测的特异性和灵敏度进行了验证，从而建立了快速、灵敏、特异性强的GCLV分子生物学检测方法。

关键词：大蒜普通潜隐病毒；反转录－聚合酶链式反应；病毒检测

中图分类号：Q 814．9

大蒜为无性繁殖作物，病毒病危害相当严重，根据1989年walkey报道，感毒大蒜产量损失可达50％，且病毒一旦侵入很难脱除，常因鳞茎母体带毒而垂直传染给后代，引起种性退化而最终毁种。

目前侵染大蒜的病毒主要是马铃薯Y病毒属、香石竹潜隐病毒属、青葱X病毒属成员，其中香石竹潜隐病毒属成员中的CCLV为侵染大蒜的主要病毒之一。它为单链正性RNA病毒，基因组RNA包裹在长度为610～690 nm的线状病毒粒子中，由蚜虫以非持久方式传播。此病毒在荷兰、德国、日本、印度尼西亚、韩国和中国都有报道。

由于多数寄主植物受GCLV侵染后不表现明显症状，病原检测显得更为重要。传统的检测方法是指示植物鉴定和DAS ELISA法。指示植物鉴定周期长、季节性强、症状易混淆，DAS-ELISA法易出现假阳性反应。而反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)可以在病毒的特异性引物作用下对其进行扩增，从而提高了病毒检测的特异性与灵敏度。ThorV.M.Fajardo等人应用此技术对巴西地区大蒜上的马铃薯Y病毒属和香石竹潜隐病毒属的几种病毒进行了鉴定，F.Takaki等人对洋葱黄矮病毒的弱毒株系进行RT-PCR全序列扩增。但是，在国内运用此技术直接检测GCLV的还未见报道。因此本试验设计了一对寡核苷酸引物，并对影响RT-PCR反应的条件进行了优化，建立了快速检测GCLV的RT-PCR检测体系，从而为GCLV的早期鉴定及病害普查提供了快捷的检测手段。

1材料与方法

1．1材料

黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所保存的大蒜普通潜隐病毒(GCLV)、韭葱黄条病毒(LY-sV)、青葱潜隐病毒(SLV)、洋葱黄矮病毒(OYDV)。将毒源接种于大蒜的繁殖寄主葱属植物上，置于温室中观察发病情况，经DAS-ELISA法检测病毒达到高峰期采收，保存于-80℃条件下备用。大肠杆菌(Escherichia coli)GM109由东北农业大学试验室提供，PMDl8-T购自TaKaRa(大连)公司。M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、EcoR I、sal I购自宝生物工程(大连)有限公司，dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司，B型质粒小样快速提取试剂盒、B型小量DNA片段快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。引物合成及序列测定委托上海生工生物工程有限公司完成。

1．2方法

1．2．1GCLV特异性引物的设计

以日本的GCLV核苷酸序列(GenBank中的登录号：AB004804)为查询序列，在NCBI的BLAST系统进行同源性比对，选择GCLV外壳蛋白区域的保守序列利用引物设计软件Primer Premier5．0进行引物设计，合成了一对引物：A1：5-GTG-GTTTGGAATGAAAT-3，A2：5-GGATC-CATTGAAGTTTGT-3。

1．2．2病毒总RNA的提取

取50 mg感病组织于1.5 mL Eppendorf管中，在液氮状态下研磨，加入600 μL提取缓冲液(50 mmol／LTris-HCl，pH 8.0；140 mmol／L NaCl；10 mmol／L EDTA；1％SDS；2％PVP；10U RNasin；2％巯基乙醇，后两种现用现加)，离心去渣取上清；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀，离心取上清；再加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，离心取上清；再加入2.5倍体积的无水乙醇和1／10体积的3 mol／L的NaAc，混匀，一20℃放置3 h后，离心，弃上清，最后用无水乙醇洗2次，真空干燥，溶于40 μL TE中备用。

1．2．3RT-PCR扩增

第1轮RT-PCR反转录体系：1.1 mmol／L的dNTP、2.5 μL的5×buffer、9.5U的RNasin、45.0U的RTase，总体积为10 μL，于42℃反应1 h；第2轮PCR反应体系：加入DNA模板4.0 μL、上下游引物各22.0 ng、2.3 mmol／L的MgC1₂、0.2 mmol／L的dNTP、1.0I的TaqDNA聚合酶、2.3 μL的10×buffer，总体积为25 μL。PcR反应程序设置：94℃，5 min；然后94℃，1 min；55℃，1 min；72℃，1 min，反应35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用QIAEXⅡGel Exreaction Kit(QIAGEN)回收纯化。

1．2．4目的基因的克隆与序列测定

将PcR扩增产物纯化后连接到PMD18-T Eas-y Vector上，转化到通过CaCl₂法制备的GM109大肠杆菌感受态细胞中，挑取加有Amp的LB平板上的单菌落，应用B型质粒小样快速提取试剂盒提取质粒，利用Ecol I和Snz工对重组质粒进行双酶切鉴定。GCLV的目的片段委托上海生工生物工程有限公司进行测定。

2结果与分析

2．1GCLV总RNA的提取

要进行核酸杂交、RT-PCR等分子生物学研究，都必须有纯度较高、完整性较好的核酸。纯的核酸OD₂₆₀nm／OD₂₈₀nm应大于1.700，表明植物组织中的酚类化合物、多糖和蛋白质等杂质抽提充分。本试验采用SDS法提取的植物总RNA，测得的OD₂₆₀nm／OD₂₈₀nm的值都在1.740以上，说明样品核酸提取的纯度及完整性均较好，见表1。

2．2GCLV的RT-PCR初步扩增

以带毒植物的总RNA为模板，利用GCLV的特异性引物进行反转录及PCR扩增，得到了长度约为300 bp的目的片段与引物设计的片段大小一致，见图1。

2．3GCLV的RT-PCR检测体系的优化

2．3．1PCR部分引物用量的优化

为减少非特异性条带和降低试剂成本，对PCR部分的试剂用量进行了优化。

首先应用上述体系对引物用量在12.0～22.0 ng进行RT-PCR扩增效果比较，由图2可以看出，引物量在12.0 ng时引物二聚体基本消失，所以引物的最佳用量为12.0 ng。

2．3．2MgCl₂浓度优化

MgCl₂浓度对RT-PCR的扩增效果影响较大，为了减少非特异性条带的影响，对MgCl₂浓度在1.5～3.0 mmol／L的范围内进行比较，由图3可以看出当MgCl₂浓度为1.5 mmol／L时扩增不到目的条带，随着浓度的增加目的条带的亮度增加，但非特异性条带的亮度也逐渐增加，且在目的条带的上下出现非特异性条带，由此可见，当MgCl₂浓度为2.0 mmol／L时扩增效果最佳。

2．3．3Taq酶用量比较

PCR反应是在TaqDNA聚合酶的催化下进行的，对PCR的扩增结果影响较大，且价格也较昂贵，所以应尽量减少其用量而得到最佳的效果，试验结果如图4可知，当Taq酶量为0.7U时目的条带最亮。

2．4GCLV的RT-PCR产物的克隆

为了进一步验证所扩增的目的片段，对其进行回收，经纯化后克隆到PMD18-T Easy Vector上，转人大肠杆菌，挑取LB平板上的单菌落，试剂盒提取质粒，最后双酶切验证得到了含有插入片段的重组子，见图5。

2．5目的片段的序列测定及同源性比较

对重组质粒的插入片段进行了测序，结果得到了长度为300 bp的目的片段，样品的序列与GenBank中发表的GCLV分离物的相应区域基因序列进行比较，结果表明核苷酸序列同源性最高可达98％，最低为90％，氨基酸序列同源性最高可达97％，最低为91％，证明所克隆的片段为GCLV外壳蛋白保守序列的一部分。其中所测序列与GCLV引物设计序列(GenBank中的序列号：AB004804)相应区域的同源性为96％，比对结果见图6。

2．6RT-PCR检测的特异性与灵敏度

2．6．1RT-PCR检测的特异性

应用该检测体系可以从感染GCLV的大蒜样品中扩增得到300 bp的目的条带，而经常与GCLV复合侵染大蒜的LYSV、SLV、OYDV的阳性对照均无此条带，见图7。

2．6．2RT-PCR检测的灵敏度

将总核酸按10倍梯度稀释，试验结果如图8可知，该体系扩增的灵敏度为10^-4病毒稀释液，相当于检测到100 ng感病组织中的GCLV。

3讨论

大蒜病毒病往往是由多种病毒的复合侵染所致，具有相似的特征，很窄和重叠的实验寄主范围，并且在感病的寄主上表现相似的症状。这些生物学特征降低了通过指示植物对大蒜病毒进行鉴定的准确性。另外大蒜病毒的传播途径、病毒寄主范围、体外保毒期、稀释限点、钝化温度、细胞质内含体形态等生物学指标也可作为病毒鉴定标准，但这些方法耗时长，且鉴定有效性差。而用血清学方法鉴定大蒜病毒仍是目前通常采用的方法，但已有研究表明，利用血清学技术进行病毒种的鉴定时结果很不可靠，同属病毒问外壳蛋白氨基酸序列同源性较高，导致不同种病毒的抗血清常常会产生交叉反应，从而造成假阳性的出现，所以利用快速、灵敏、特异性强的RT-PCR分子检测技术来检测大蒜病毒显得尤为重要。

本试验根据GCLV的核苷酸保守序列设计合成了一对引物，建立了GCLV的RT-PCR分子检测体系，并对影响PCR反应的主要试剂用量进行了优化，结果表明：当引物用量为12 ng，MgCl₂浓度为2.0 mM，Taq酶用量为0.7U时目的片段的亮度达到最佳，基本消除了非特异条带的干扰，且减少了Taq酶用量使检测体系更加经济。

本试验为了进一步证实扩增的目的片段与理论设计的片段相符，从而对目的片段进行了克隆和序列测定。测序结果与GCLV的其他分离物相应区域的序列同源性最高达98％，证明所克隆的片段为GCLV核苷酸保守序列的一部分。

由于同属病毒之间及侵染同一植株的不同病毒之间的序列可能会存在一定的同源性，所以本试验对GCLV检测体系的特异性进行了验证，结果表明该体系对经常与GCLV复合侵染大蒜的LYSV、SLV、OYDV的阳性对照均不能得到扩增，表明GCLV检测体系的特异性较强。该检测体系的灵敏度为10^-4病毒稀释液，相当于检测到100 ng感病组织中的GCLV，其灵敏度远远高于血清学检测，且可以在2 h内完成整个检测过程，这为大蒜脱毒苗的检测和大田病害的早期诊断提供了更加快速准确的检测方法。此检测体系也为进一步扩增病毒的基因组全序列，构建病毒的系统进化树及区分同属病毒不同种之间的差异和不同属病毒之间的关系奠定了基础。