抗感枯萎病黄瓜品种的病理组织结构学研究

马艳玲　吴凤芝　刘守伟

摘要：选取不同抗性黄瓜品种中农13(抗)和中农6号(感)为试材，采用蘸根法接种，利用电镜技术和石蜡切片方法观察了病菌侵染前后根茎组织结构的变化。结果表明，抗病品种有环纹和网纹两种导管类型，有较厚的角质层，感病品种有环纹导管一种类型，无角质层。抗病品种在接种后细胞壁加厚、导管腔内出现褐色物、胞壁覆盖物以及侵填体。感病品种仅出现胞壁加厚和胼胝体。对于病原菌侵染，抗感品种具有不同程度的反应，抗病品种反应程度早于且强于感病品种。

关键词：黄瓜；枯萎病菌；组织病理学

中图分类号：S 432．23

枯萎病属于维管束病害，是影响黄瓜生长的主要土传病害之一。常年发病率10％～30％，重病年份可达80％～90％，其病原菌为半知菌亚门镰孢属的尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cu-cumerinum Owen)，我国流行的菌系为生理小种4号，引起这类病害的镰孢属真菌是土壤习居菌，病菌孢子的芽管或菌丝体由根毛侵入或通过根部伤口侵染植物。由一个孢子的一次侵染就足以引入病原物到植物内部。寄主植物的抗病性分为组织结构抗性和生理生化抗性两个方面，组织结构抗病性是利用组织和结构的特点阻止病原物的接触、侵入和扩展。本试验对不同抗性黄瓜品种接种枯萎病菌，目的是探讨寄主植物在组织结构方面的抗性机制。

1材料与方法

1．1供试材料

供试黄瓜品种为中农13(抗病)和中农6号(感病)，种子由哈尔滨市农科所提供。

1．2供试菌种

尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp．cucumerinum)分离于东北农业大学试验实习基地温室内的黄瓜枯萎病病株。病原菌的分离、纯化、培养及孢子悬浮液的制备参照王拱辰等、方中达的方法。

1．3试验方法

供试品种种子经表面消毒后，播于灭菌的沙箱中，出苗后按日本山崎配方施营养液。成分为Ca(NO₃)₂·4H₂O826 mg／L，KNO₃607 mg／L，NH₄H₂PO₄115 mg／L，MgSO₄·7H₂O483 mg／L，微量元素为：NaFe-EDTA 20～40 mg／L，H₃BO₃2.86 mg／L，MnSO₄·7H₂O 2.13 mg／L，ZnSO₄·7H₂O0.22 mg／L，CuSO₄·5H₂O 0.08 mg／L，(NH₄)₆Mo₇P₂₄·4H₂Omg／L。待幼苗长至3～4片真叶时清水洗净根部沙粒，再用蒸馏水冲洗2次后，在1×10⁷个／mL的孢子悬浮液中浸根30 min，浸没深度1 cm左右。之后取出放入上述营养液中水培。定期切取根茎部观察。

将切取的1mm大小的材料放入4%戊二醛中进行前固定，pH7.2磷酸缓冲溶液冲洗，1％锇酸后固定，梯度乙醇一丙醇脱水，Epon-812环氧树脂包埋，超薄切片机切片，双重染色后，在透射电镜下观察细胞结构的变化以及病原真菌的侵染状况。

石蜡切片制样采用蕃红固绿双重染色法，参照李桂琴的方法。

2结果与分析

2．1枯萎病菌对抗病黄瓜品种的侵染过程及病理组织学变化

图1是抗病品种枯萎病菌侵染过程及病理组织学变化，结果显示：接种后16 h，抗病品种根茎部的角质层表面附着大量有隔或无隔的分生孢子(图1a)，由于角质层较厚，开始萌发的孢子长出的菌丝体因难以有充足的营养提供而部分死亡。而入侵到表皮细胞的菌丝体在细胞间隙内生长，附近细胞出现质壁分离(图1b)，薄壁细胞有细胞壁加厚现象(图1c)，细胞内容物丰富(图1d)，线粒体清晰(图1e)。接种后40 h，发现通过皮层薄壁细胞的菌丝产生的孢子(图1f)，以及薄壁细胞连接处的孢子(图1g)，同时观察到细胞壁增厚及断裂现象(图1h)。第64 h，在导管附近出现少量菌丝及其孢子(图li)，而同时导管腔出现大量褐色物(图1j)，并且发现有的导管壁分泌一层覆盖物(图lk)，而周围并无菌丝。88 h后，导管内产生一个侵填体(图1e)。

2．2枯萎病菌对感病黄瓜品种的侵染过程及病理组织学变化

图2是感病品种枯萎病菌侵染过程及病理组织学变化，结果显示：在接种后16 h，根茎部表皮细胞由于无角质层的覆盖而被萌发的孢子降解(图2a)。内皮层薄壁细胞内线粒体、高尔基体等细胞器发育良好，清晰可见(图2b、c)。接种后40 h，皮层薄壁细胞细胞壁溶解，内有大量孢子(图2d)，线粒体外膜部分断裂，脊模糊不清(图2e、f)，细胞间隙有大量菌丝，同时胞壁变厚(图2g)。第64 h(图2h、i)，细胞变形，内容物溶解(图2h)，在胞壁断裂处有小孢子出现(图2i)。第88 h，筛管内的菌丝在向前生长时遇到胼胝体(图2j)。

2．3抗感枯萎病黄瓜品种根茎导管类型的差异

图3是抗感黄瓜品种根茎导管类型差异，结果显示：抗病品种的导管类型有两种，即环纹导管和网纹导管(图3a、b)；感病品种仅有环纹导管一种类型(图3c、d)。

3讨论

史金瑞、苗琛等在西瓜枯萎病的细胞学研究中发现，抗病品种比感病品种具有较厚的角质层，本试验结果与此相类似。程玉瑾等在研究西瓜枯萎病时没有发现抗感品种西瓜根部存在结构差异。徐建华等对黄瓜枯萎病的研究中发现抗病品种较感病品种的壁覆盖物厚、抗病品种中侵填体有细胞核，感病品种中侵填体发育不充分。Mace等认为壁覆盖物、侵填体、褐色物等这些保卫反应的产生限制了菌丝扩展，对菌丝的入侵具有一定的阻碍作用。陈珉等认为感病品种的螺纹导管较多，而抗病品种以网纹导管为丰。本试验结果表明，选取的两个黄瓜品种存在结构上的差异，抗病品种有角质层，有环纹和网纹两种导管类型；感病品种无角质层，有环纹导管一种类型。抗病品种受到病菌侵染后，较早的产生细胞壁增厚，褐色物，侵填体等，感病品种仅产生胞壁加厚和胼胝体。由于本试验仅选取2个品种，试验结果的普遍性有待于对更多的材料进行研究才能确认。