新疆棉花立枯病根际拮抗放线菌的筛选

纪春艳　王新荣　程路明　王纯利

摘要：从采集的新疆棉苗根际土样中经分离、纯化获得优势放线菌菌株95个，采用平板对峙培养法对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)进行根际拮抗放线菌的筛选。结果表明．共获得根际拮抗放线菌菌株22株，其中菌株M-1抑菌谱广，抑菌活性强，热稳定性较好，是一株具有良好应用潜力的防治棉花立枯病的生防菌。

关键词：棉花；拮抗放线菌；立枯丝核菌；抑菌活性

中图分类号：Q 939．92

微生物农药作为生物农药的重要类群，以其低毒低残留、对非靶标生物及环境安全等特点而备受重视。放线菌是微生物农药的重要来源，分布广泛，种类繁多，筛选出的活性物质具有产业化生产的优势。放线菌是植物根际微生物群落的重要组成部分，通过有效定殖，重寄生，产生抗生素、植物生长调节素，分泌几丁质酶、葡聚糖酶、过氧化物酶等机制促进植株生长，抵抗病原菌的侵染。放线菌作为生防菌已在生产上被成功地应用，如土壤放线杆菌(Agrobacteriurn radiobacter 84)，利用其活菌制剂及其产生的抗生素(agriOcin-84)能够有效防治核果和玫瑰根痛病。由立枯丝核菌(Rhizoctonia so-lani)引起的棉花立枯病是新疆棉花苗期的重要病害，对棉田的高产和稳产带来严重影响。本研究从新疆主要棉花种植区的棉苗根际筛选到一批对立枯丝核菌抑菌效果较好的放线菌菌株，并对其中抑菌谱广、抑菌活性强的菌株M-1进行稳定性的初步研究，现报道如下。

1材料与方法

1．1供试病原菌

立枯丝核菌：Rhizoctonia solani AG-4；尖孢镰刀菌：Fusarium oxysporum；大丽轮枝菌：Verticillium dahliae Kleb；根串珠霉：Thielavi-opsis basicola；苎麻疫霉：Phytophthora boehmer-iae Sawada，以上菌株均由新疆农业大学植物病理室提供。

1．2培养基

土壤分离培养基：高氏1号培养基：琼脂15 g，可浴性淀粉20 g，NaC1 0.5 g，KNO₃1 g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.5。

发酵培养基：可溶性淀粉45 g，花生饼粉22 g，(NH₄)2SO₄2.6 g，NaCl 2.6 g，CaCO₃2.6 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.2。

马铃薯琼脂糖培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0。

1．3棉苗根际土样采集及根际放线菌的分离、培养

在新疆阿克苏、昌吉、石河子、玛纳斯、呼图壁、博乐6个棉花种植区进行采样，采集棉花立枯病发病较严重的棉田中的健康棉苗(附带根围土)，装入灭菌纸袋，低温保存，进行分离。

将棉苗根上松散的附着土抖掉，自根茎处剪断，称取1 g根，用无菌水漂洗3次，置于9 mL无菌水的离心管中，制备不同稀释液的根际土壤溶液，涂布于高氏Ⅰ号平板，28℃培养，观察、计数，进行根际放线菌含菌量的测定，挑取不同形态的菌落画线纯化，镜检、保存。

对纯化的根际放线菌菌株进行摇瓶发酵培养，250 mL三角瓶中装入40 mL发酵培养基，接种量ф=10％，摇床转速160 r／min，28℃振荡培养4 d。

1．4拮抗放线菌的筛选

采用平板对峙培养法，将已培养3 d的立枯丝核菌用5 mm的打孔器打成菌丝块，移到PDA平板的中央，将待筛选的放线菌的发酵培养液在离立枯丝核菌等距离的3个角上接种，每个角上放置的5 mm滤纸片上各滴加发酵液50μL，28℃培养，测量抑菌带的宽度，观察各放线菌菌株对立枯丝核菌的抑菌作用，选择抑菌作用明显的菌株作为拮抗放线菌。每个处理重复3次，以不接供试放线菌菌株的平板作为对照(CK)。

1．5抑菌谱的测定

将1.4中获得的初筛拮抗放线菌菌株分别与棉花枯萎病(尖孢镰刀菌)、棉花黄萎病(大丽轮枝菌)、棉花黑根腐病(根串珠霉)以及棉花疫病(苎麻疫霉)4种棉花病害的病原菌进行平板对峙培养，测定抑菌谱。

1．6菌株M-1稳定性的测定

将1.5中获得的抑菌谱广、拮抗活性强的菌株M-1发酵液经离心后所得的上清液进行以下稳定性测定。以发酵原液作为对照，重复3次。

1．6．1热稳定性测定

将M-1发酵上清液分别于60、80、100、121℃处理60 min，对立枯丝核菌对峙培养，测定其抑菌圈的直径。

1．6．2pH稳定性

将M-1发酵上清液的pH值分别调至2、4、6、8、10、12后，对立枯丝核菌对峙培养，测定其抑菌圈的直径。

1．6．3紫外光稳定性

将M-1发酵上清液置于30 w紫外光下，距离30 cm，照射12 h后，对立枯丝核菌对峙培养，测定其抑菌圈的直径。

2结果与分析

2．1棉苗根际放线菌分离和拮抗放线菌初步筛选

由表1可知，从阿克苏、昌吉、石河子、玛纳斯、呼图壁、博乐6个棉花种植区共采集棉苗根际土样48份，不同地区的棉苗根际放线菌种群密度差异较大，其中石河子根际土壤的放线菌含量最高，而阿克苏的最低。经分离、纯化，共获得优势放线菌菌株95株，其中，玛纳斯土样中获得的放线菌菌株数较多，虽然石河子根际土壤中的放线菌含量最高，但其获得的优势放线菌菌株数最少，可能其根际放线菌的主要类群相对其他地区较单一。采用平板对峙法，测定95个放线菌菌株对立枯丝核菌的抑菌作用，初步筛选到有抑菌作用的拮抗放线菌22株，约占分离总株数的23％，初筛拮抗细菌菌株的抑菌活性强弱有所不同，可以分为3类：抑菌活性强(3级)的12株，占54％；抑菌活性较强(2级)的3株，占14％；抑菌活性较弱(1级)的7株，占32％。

2．2初筛拮抗放线菌菌株的抑菌谱测定结果

挑选2.1中的初筛放线菌22株，对4种棉花重要病害的病原菌进行抑菌谱的测定，结果见表2。由表2可知，抑菌谱可分为3类：(1)抑菌谱广，对立枯丝核菌及其他供试菌株中的3个菌株均有很强的抑菌活性(3级)，如M-1，B-14等；(2)抑菌谱较广，但对供试菌株的抑菌活性不一致，如：AF-2，M-4等；(3)抑菌谱窄，抑菌活性较低，仅对立枯丝核菌具有抑菌活性，而对其他供试菌株无抑菌活性，如AF-8，H-12。

2．3菌株M-1的稳定性

由图1可知，与对照相比，M-1发酵液在80℃以下温度处理60 min，对其抑菌活性没有影响，经121℃处理60 min后，对立枯丝核菌仍然具有抑菌活性，M-1具有较好的热稳定性。

与对照(pH7.2下，抑菌圈直径为22.5 mm)相比，pH变化对M-1抑菌活性的影响如表3所示，在pH6～8之间稳定，pH4、pHl2下M-1的抑菌活性明显降低，pH2时活性完全丧失。

将M-1发酵液经紫外光照射12 h后，抑菌圈的直径为15.5 mm，对立枯丝核菌的抑菌活性明显下降。

3讨论

近年利用拈抗细菌对新疆棉花立枯病进行生物防治的研究已有相关报道。张亚平等从北疆棉花根际土壤中筛选到的芽孢杆菌7B-1能够引起立枯丝核菌菌丝溶解和畸形；罗明等从新疆不同种植区的棉花植株组织中分离获得一批对立枯丝核菌抑菌作用较强的菌株；阎小雪等筛选获得对立枯丝核菌温室防效较好的10株芽孢杆菌，其中有3株的田间小区试验防效较好。有关对新疆棉花立枯病进行拮抗放线菌筛选的研究报道目前尚未见到。作者从新疆主要棉花种植区的棉苗根际筛选获得一批对立枯丝核菌抑菌效果较好的放线菌菌株，其中菌株M-1对立枯丝核菌、大丽轮枝菌、根串珠霉以及苎麻疫霉的抑菌活性均很高，抑菌谱广，热稳定性较好，最适合的pH范围为6～8，对紫外光敏感。这些为该菌株有效活性物质的分离纯化提供了初步理论参考，下一步将对该菌株活性物质的纯化鉴定、理化性质、最佳发酵培养条件的优化等进行深入研究。棉花立枯病是一类土传苗期病害，植株在苗期的生长状况与其抗病性密切相关，有必要对菌株M-1在棉株根部的定殖、是否具有促生长、诱导棉株抗病性产生等抑病机制进行系统研究，从而为大田应用提供必要的理论依据。