白芷黑斑病病原菌鉴定及病害发生规律研究

喻　霜　叶华智　严吉明

摘要对四川白芷黑斑病的症状、病原菌致病性和形态特征等进行了研究，确定病原菌为当归叶点霉(Phyllostictaangelicae Saccardo)。经两年的田间病害发生动态调查，该病在四川始发期为3月上旬，高峰期为6月份，病株率达100％，病叶率达74.51％。病害的初侵染源主要是留种株的病叶和田间病残体。病菌分生孢子借雨滴飞溅的方式传播，并在白芷生长期中不断引起再侵染。

关键词白芷；白芷黑斑病；当归叶点霉；发生规律

中图分类号S 435.672

白芷(Angelica dahurica)为我国传统中药材，属伞形科当归属多年生草本植物，以根入药，同时也是一种香料和调味辅料。川白芷为川产地道药材，主产于四川遂宁，其产量约占全国商品白芷总产量的70％。近年来，在四川遂宁等白芷种植区普遍发生了一种新病害——白芷黑斑病，该病蔓延迅速，病情严重，导致叶片枯死，植株早衰，已经成为产区白芷的主要病害之一。迄今未见有白芷黑斑病的研究和报道。为了明确引起该病的病原、掌握病害田间发生发展规律，笔者对白芷黑斑病进行了病原菌的分离鉴定和致病性测定，同时于2006—2007年连续两年调查了该病的田间发生动态和病害循环。

1材料与方法

1．1病原菌的分离与鉴定

1．1．1症状观察

在四川省遂宁市白芷生产基地采集病害样本进行观察，纪录病害症状。

1．1．2病原菌的分离和致病性测定

采集有黑斑病症状的白芷病叶，按常规组织分离后再经单孢纯化培养，获得菌株。用无菌水配制孢子悬浮液，对白芷健株进行喷雾接种，塑料袋保湿48 h，发病后观察症状特征并再次分离鉴定病原菌，完成柯赫氏法则检验。

1．1．3病原菌的种类鉴定

分别对病斑上的病原菌子实体和致病性测定的分离菌的培养性状、分生孢子器及分生孢子的形态大小进行测定，并按照真菌分类标准进行种类鉴定。

1．2病害发生规律研究

1．2．1病害田间发生动态调查

白芷是跨年收获的药材，在当年9月中旬至10月上旬播种，次年的7月底至8月中旬收获。田间病害发生动态的调查时间为2006年2～7月和2006年11月至2007年6月两个白芷生长季，调查地点在四川遂宁白芷生产基地。选取2处田块作为定点调查地，采用五点法，取对角线上的5点，定点定株调查，每隔15天左右调查1次病害的发病率及严重度(按5级分级标准)，并计算病情指数。此外，还在田间大范围观察白芷黑斑病的发病情况。病叶严重度分级标准如下。

0级：整叶无病斑；

1级：病斑面积占全叶面积＜1/4；

2级：病斑面积占全叶面积的1/4～1/2；

3级：病斑面积占全叶面积的1/2～3/4；

4级：病斑面积占全叶面积＞3/4。

1．2．2病原菌存活力的测定

2006年7月从田间采集病叶，风干后保存于室内。定期剪取病斑，置于无菌水中使分生孢子器内的分生孢子释放出制成孢子悬液，采用玻片萌发法，在20℃下，48 h后观察分生孢子萌发情况，计算孢子的存活率；同时取病斑病健交界处，用常规组织分离法进行分离，测定菌丝体在病组织内的存活时间，为了解病菌的越冬越夏提供一定依据。

1．2．3留种株上病原菌越冬越夏的调查

白芷采用种子繁殖，一般在7月挖收白芷时选取植株栽植，次年6～7月开花结实收取种子。因此留种株上是否有黑斑病发生，是掌握病菌越冬越夏场所的重要方面，为此，对留种株上的黑斑病发生情况进行了田间调查观察。

2结果与分析

2．1病害症状

白芷黑斑病主要危害叶片，亦可危害叶柄和茎(图1)。叶部发病初期呈现水浸状小斑点，逐渐扩展为近圆形或不规则形的暗褐色病斑，直径3～15 mm，后期病斑中部颜色变浅，边缘仍保持暗褐色；病斑表面散生小黑点(分生孢子器)，病健交界处有时会出现褪绿黄色圈。植株成叶发病较重，幼嫩新叶发病较轻。叶柄和茎上的病斑为长条形暗褐色，稍凹陷。

2．2柯赫氏法则验证

用分生孢子悬浮液喷雾接种白芷叶片，6～8 d后出现水浸状小点，15 d左右形成暗褐色典型病斑，与田间自然发病症状相似。对病菌进行组织分离，获得了相同病原菌，证明该菌是白芷黑斑病的致病菌。

2．3病原菌种类鉴定

病原菌的分生孢子器叶面生，多为散生，球形、扁球形，直径70～135 μm，器壁褐色至暗褐色，初埋生后突破表皮，孔口外露，圆形，周围细胞颜色较深。分生孢子单胞，无色，椭圆形，具有1个油球，大小(3.3～5.0)μm×(1.7～2.2)μm，有黏液，孢子不易分散(图2)。叶片上的分生孢子器遇水或有露滴时释放出分生孢子，有时在孔口聚集成淡黄色黏质团。

在PDA培养基上，病菌菌落圆形平铺，短绒状，初为灰白色，后期转变为褐色；菌丝无色或淡褐色，有分隔；分生孢子器初为黄褐色，成熟后为黑色小点，当湿度很高时从孔口中溢出分生孢子，聚集形成奶油色的分生孢子团；分生孢子器直径为65～130μm，分生孢子大小为(2.8～4.5)μm×(1.8～2.0)μm，两者在形态和大小方面都与植物组织上观察到的相近。

参照有关资料，确定川白芷黑斑病的病原菌为半知菌亚门叶点霉属的当归叶点霉(Phyllos—ticta angelicae Saccardo)。

2．4病害田间发生动态研究

白芷黑斑病在田间的一般发生发展情况是：田间最早出现的病株多在白芷留种田附近以及连作地内；病害最早发生在植株下部叶片，逐渐向植株上部叶片及邻近植株扩展，发病初期有明显的中心病团。

2006—2007年对白芷黑斑病两个生长季的田间发生动态调查结果见图3、4：在白芷秋播的幼苗上未发现黑斑病；病害始发期2006年为4月15日、2007年为4月1日，其病株率、病叶率分别为10.50％、3.52％和12.50％、5.85％。2006年4月底至5月中旬病害发展迅速，5月15日病株率和病叶率达88.50％和41.32％；2007年春为暖春，病害的发生和发展较2006年同期更早更快，在4月期间病情急剧发展，5月1日病株率、病叶率分别升至80.00％和39.15％。2006年病害高峰期为6月15日，病叶率达66.05％，到7月1日病情指数为35.25；2007年6月1日病害进入高峰期，病叶率升至最高74.51％，6月20日病株率高达100％，病情指数为37.04。至此，白芷进入了生育后期，叶片普遍出现生理性变黄枯萎，病情发展基本停止。

通过田间大范围的发病观察，该病始发期2006年为3月13日、2007年为3月1日，病害的消长情

况与定点调查结果基本一致。

2．5病原菌存活力的测定

2．5．1分生孢子存活力测定

对病叶上病菌分生孢子的萌发率测定结果表明(图5)：从2006年7月采回病叶到11月1日，分生孢子的萌发率为80.33％。以后随时间延长，孢子萌发率逐渐下降，到2007年4月15日，孢子的萌发率仍有4.21％。

2．5．2病叶中菌丝体的存活测定

用组织分离法，自120 d起不能再从病叶标本里分离出病原菌，说明菌丝体在室温下在病组织内的存活时间约为4个月。

2．6田间留种株上的病害观察

7月下旬至8月中旬生产上栽植留种株，8月下旬留种株叶片上见有黑斑病发生，并在其上缓慢扩展；11月份进入冬季，病害基本停止发展；直至次年的春季气温回升后，病害又继续在留种株上蔓延。

2．7不同白芷品种上的发病情况

2007年在田间病害基本稳定时(6月中旬)，在遂宁白芷生产基地品比试验田中对不同品种白芷上黑斑病的发生情况进行了调查，结果说明在发病的严重程度上各品种之间存在一定差异(表1)。

3结论与讨论

白芷黑斑病为四川白芷上的一种新病害，虽然近年在种植区发生严重，但至今尚未见有对该病害的研究报道。病原菌的鉴定是研究病害的一个重要基础性环节。文献中仅有于莉等1994年在东北兴安白芷叶片上发现了一种叶点霉寄生菌一当归叶点霉(Phyllosticta angelicae Saccardo)；此后陈小红等报道四川白芷的黑斑病病原菌为Phyllostic-ta sp.。笔者在此基础上对四川白芷上的黑斑病进行了较系统的研究，确定引起川白芷黑斑病的病原菌为半知菌亚门叶点霉属的当归叶点霉。

研究病害的田间发生动态，对了解病害的发生规律和防治有重要的理论和实践意义。四川遂宁属亚热带湿润季风气候，全年气温温和，降雨充沛，日照充足，适宜白芷黑斑病的发生和发展。随着近几年种植面积的扩大和集约化栽培，该病在当地危害逐年加重。综合2006—2007年对白芷黑斑病田间发生动态的研究，结论是：该病始发期为3月上旬；4月至5月上旬主要向周围植株水平扩展，病株率增长较快；5月中旬至6月中旬主要向植株上部叶片垂直扩展，病情指数明显升高，高峰期为6月份。由于黑斑病菌的分生孢子在分生孢子器内，当高湿或遇水露时才释放出分生孢子，因此病菌主要靠雨滴飞溅的方式传播；加上病菌产孢量大、致病性强，在生长季不断引起再侵染，白芷叶片大而平展、密集，皆易于该病害的传播和流行。

对病原菌分生孢子和病组织中菌丝体存活力的测定，以及田间留种株上黑斑病的发病情况调查结果表明：病原菌主要以菌丝体和分生孢子器在田间病残体和留种株上越夏越冬，以分生孢子作为初侵染来源。因此做好秋季田间病残体的清理，并及时摘除留种株上的病叶和药剂防治，可有效减少病害初侵染源。