草地螟触角普通气味结合蛋白基因的克隆及序列分析

钟　涛　尹　姣　刘　怀　王进军　李克斌　韦永贵　曹雅忠

摘要利用RT-PCR结合RACE技术克隆了编码草地螟(Loxostege stzcticalis)触角中一种普通气味结合蛋白的基因。序列分析表明，成熟蛋白的序列中含有阅读框序列，推导的氨基酸序列与已报道的11种鳞翅目昆虫普通气味结合蛋白I比较，平均相似度在62.3％左右，并拥有气味结合蛋白的典型结构特征。该基因归属于普通气味结合蛋白I基因亚族。因此将它命名为LstiGOBPl。

关键词草地螟；触角；普通气味结合蛋白；RT-PCR；RACE

中图分类号Q 785，S 433.4

草地螟[Loxostege sticticalis(Linnaeus)]又名网锥额野螟、甜菜网螟，属鳞翅目、螟蛾科、野螟亚科、锥额野螟属，是我国东北、华北和西北地区发生的多食性害虫之一，取食为害大豆、苜蓿和甜菜等作物，具有远距离迁飞为害和周期性暴发特性，严重威胁了我国北方的农牧业生产。

草地螟对寄主植物具有明显的选择取食、产卵为害的特性，其中，嗅觉识别又是蛾类感知寄主植物信息的重要方式。灵敏的嗅觉在草地螟搜寻合适的寄主植物及选择产卵地的过程中发挥着重要作用，而触角作为昆虫最主要的嗅觉感受器官，能够依靠化学物质进行信息的传递，从而在数万种化合物分子中识别出它所需要的气味分子。已有研究证实，在鳞翅目、双翅目、鞘翅目和膜翅目等全变态昆虫中都发现了气味结合蛋白(OBPs)的存在，这种蛋白能结合疏水性气味化合物，并携带它们快捷地穿过水溶性的淋巴液，实现气味在触角表皮与嗅觉神经元上的膜结合受体之间传递。

目前，对草地螟与寄主植物之间的化学通讯研究比较缺乏，仅在草地螟对寄主植物的选择性及寄主植物的挥发物质行为反应等方面进行了研究。因此，开展草地螟感知、识别寄主的分子机理方面的研究不仅能够揭示其选择寄主植物的分子机制，而且还可以为进一步了解草地螟与寄主植物之间的化学信息联系，阐明草地螟选择寄主产卵与取食的内因提供可靠的理论依据，同时为研制、开发防控草地螟的药剂提供新思路。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1供试昆虫

草地螟幼虫用野生灰菜饲养，成虫羽化后3 d内分别剪下雌、雄触角，立即放在液氮中速冻，然后-70℃保存。

1．1．2菌种及质粒

pGEM-T Easy载体购自Promega公司，感受态大肠杆菌DH5a购自北京博大泰克公司。

1．1．3主要试剂及工具酶

Ex Taq DNA聚合酶，限制性内切酶EcoR I、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、3'-Full RACE CoreSet购自TaKaRa公司，Ampicillin、X-gal、IPTG购自北京博大泰克公司，总RNA提取试剂盒、cDNA第1链合成试剂盒等购自QIAGEN公司，质粒小量快速抽提试剂盒及DNA Marker(DL4000和D50)购自北京明日百傲公司，其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1．2方法

1．2．1触角总RNA的提取及cDNA第1链合成

将保存的草地螟雌、雄成虫触角各取20 mg，加液氮捣碎组织后，使用QIAGEN公司的RNeasyMini Kit提取总RNA，经NanoDrop核酸浓度仪测定含量后，使用cDNA第1链合成试剂盒合成CD—NA第1链。

1．2．2引物设计

根据GenBank中已登录的其他蛾类昆虫的GOBPl基因序列[家蚕(Bombyx mori)、黄地老虎(Agrotis segetum)、小地老虎(A.ipsilon)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、烟芽夜蛾(Heliothis vi—rescens)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、中国柞蚕(Antheraea pernyi)、烟草天蛾(Manduca sexta)、烟实夜蛾(Helicoverpa assulta)的GenBank登录号分别为NM_001044031、DQ838577、DQ838578、AY049739、 X96862、EFl59978，Y10970、M73797、AY864774]设计并合成引物：正向引物(gps4)：5-GTBATGAARGAYGTCACBCTNGG-3；反向引物(gpa4)：5-AGGTTRAAGTGBCKGCTCAT-3(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。

1．2．3PCR扩增

以合成的cDNA第1链为模板，反应体系为cD-NA 2μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP2taL(各2.5 mmol/L)，TaKaRa Ex Taq(5U/μL)0.25μL，正反引物各1μL(10 μmoL/L)，加灭菌水至25μL，混匀、离心，然后放入PCR仪(Eppendorf Mastercycler Gra—dient)扩增。反应条件为94℃变性3 min；接着35个循环，循环条件为94℃45 s，56.6℃45 s，72℃1 min，最后72℃延伸5 min。扩增完毕后，用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定、纯化，并回收目的片段。

1．2．4PCR产物的克隆和鉴定

利用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收PCR产物，将纯化得到的DNA连接到pGEM—T Easy载体，再转化到感受态大肠杆菌DH5a中，然后涂布在含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃培养16 h。待长出蓝、白斑后，随机挑取白斑，培养后采用质粒小量快速抽提试剂盒提取质粒，利用菌落PCR和EcoR工酶切的方法，鉴定重组克隆PGEM/LstiGOBPl。

1．2．5序列测定和分析

DNA的序列测定在北京奥莱博生物科技有限责任公司进行。

1．2．6RACE扩增

以RT-PCR得到的目的DNA序列，按照试剂盒的要求设计引物，并参照说明书扩增该基因的cDNA的3末端序列。目的DNA片段的上游特异性引物(3R-g01)：5-GACGGAGGAGTTCTTC—CACTTCTG-3(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；试剂盒中的下游接头引物(3sites Adap—tor Primer)：5-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3。

1．2．7RACE产物的克隆和鉴定

方法参照1．2．4 PCR产物的克隆和鉴定。

1．2．8序列测定和分析

DNA的序列测定在北京奥莱博生物科技有限责任公司进行。

2结果与分析

2．1GOBP1基因的扩增和克隆

以草地螟触角cDNA为模板扩增的DNA产物，分别进行琼脂糖凝胶电泳分析

。从中可以明显看出，PCR及3RACE扩增的产物长度分别达到170 bp和500 bp左右，并且它们分别经EcoR I酶切后得到的条带与设计相符。

2．2序列测定和分析

草地螟CK)BPl基因的核苷酸序列，推导的氨基酸序列位于核苷酸序列之下，方框内为保守的半胱氨酸位点。该基因已在GenBank中登录，登录号为EU413989。

序列测定和结果分析表明，已获得草地螟(X)BPl基因开放阅读框为423 bp，编码142个氨基酸残基，预测的分子量为16.1ku，等电点为5.00。该蛋白拥有气味结合蛋白的共同特征，序列中含有6个保守的半胱氨酸位点，呈酸性，且雌雄虫GOBPl的核苷酸序列相同。

利用DNASIS软件，根据Robson的方法对编码GOBPl-Lsti的mRNA进行了二级结构预测，结果表明该基因的二级结构主要为a一螺旋。此外，采用Kyte和Doolittle等的方法对GOBPl-Lsti氨基酸序列进行亲脂性分析，表明该蛋白中包含3个亲脂性区域。这些区域很可能是亲脂性气味物质的结合位点。

利用NCBI BLAST network server在Gen—Bank/EMBL中进同源性搜索发现，在GenBank/EMBL中登录的有完整序列的昆虫GOBPl基因共11种。基于序列的同源性比较发现(表1)，昆虫GOBPl氨基酸序列具有明显的同源性，平均相似度在62.3％左右。

通常物种间的亲缘越近，GOBPl的核苷酸和氨基酸序列的同源性也会越高。从LstiGOBPl与其他11种已知蛾类的进化树可以看出，草地螟与它们在进化水平上相隔很远。因此，相对其他11种蛾类来说，草地螟与它们的亲缘较远。

3讨论

本试验利用RT-PCR结合RACE技术从草地螟触角RNA中克隆了编码草地螟GOBPl的基因，根据测序结果推导的氨基酸序列具有气味结合蛋白的典型特征，属于GOBPl蛋白亚族，并依据惯例将它命名为LstiGOBP1。

鳞翅目昆虫触角中的普通气味结合蛋白(GOB—Ps)的基因序列高度同源，氨基酸和核苷酸序列都非常保守。在LstiGOBPl蛋白序列中包含7个半胱氨酸位点，其中6个半胱氨酸的空间分布在不同的物种间始终恒定(图6)。半胱氨酸普遍遵循着这样一个规则，X₁₈-Cys-X₃₀-Cys-X₃-Cys-X₄₂-Cys-X_8-10-Cys-X₈-Cys-X_24-26，其中X代表任意氨基酸。而这6个保守的半胱氨酸在LstiGOBPl的空间分布恰好符合X₁₅-Cys-X₃₀-Cys-X₃-Cys-X₄₂-Cys-X₁₀-Cys-X₈-Cys-X₂₇，很显然，LstiGOBP1的N末端还不十分完整。

在对草地螟普通气味结合蛋白家族的两个成员(GOBPl和GOBP2)的分析中(另文发表)，发现GOBPl基因并没有GOBP2基因那样在分科水平上高度保守，而是呈现出离散的特点，例如97—100、117—122氨基酸之间具有明显的差异，这可能反映了LstiGOBPl在进化中的变异与功能的分化。Krieger提出气味结合蛋白的种类在昆虫触角中是极其庞大的观点，而Vogt也认为OBPs的种类和变异恰好反映了昆虫间化感行为的多样性。

可以通过二硫键的联结信息来了解翻译后的蛋白修饰情况。经SCRATCH预测LstiGOBPl的蛋白序列，二硫键的发生位点分别在Cysl6-Cys51、Cys105-Cys119和Cys94-Cys114。而Leal在对家蚕信息素结合蛋白基因的二硫键结构的研究中发现，该蛋白中存在3个二硫键，分别位于Cys19-Cys54、Cys50-Cys108和Cys97-Cys117。考虑到LstiGOBP1蛋白序列还不完整，所以与Leal的研究结果是一致的。但仅仅在第2个二硫键的构成上有所不同，在LstiGOBP1蛋白序列中，由第5(Cys105)与第7(Cys119)共同形成了二硫键。这种差异很可能决定了GOBP1结合气味因子的形状和种类。此外，在多数已研究的蛾类中，都存在着第7个半胱氨酸，而且它的位点也是十分保守的(图6)。

GOBPs的三维结构目前还不十分清楚，但是其疏水和亲水结构域在载体蛋白中的特性分布非常重要，Krieger预测的疏水结构域通常在第40～60个氨基酸之间，这可能是用来结合气味化合物的区域。Steinbrecht的研究小组证实GOBPs在触角中是专一表达的，分布在含有特殊识别功能的受体细胞的感觉器中，它们只对食物和寄主气味有特殊反应，但不包括信息素分子。Feng也证实GOBPl具有更广泛地结合绿色植物和有花植物的气味分子的功能。LstiGOBP1同样包含了交替变化的疏水和亲水结构域，这种结构决定了其结合气味分子并运送的功能。

通常GOBP1成熟蛋白包含144～146个氨基酸，而氨基酸数目的恒定也维持GOBP1蛋白的功能稳定。N末端亲水性区域通常有18～26个氨基酸，该肽段揭示了信号肽的性能特征信息。目前，在LstiGOBP1序列中还未包含完整的N末端信息，5RACE试验正在开展之中。