绿色荧光蛋白及其在丝状真菌研究中的应用

徐　莹　刘太国　何月秋　陈万权

摘要绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)来源于海洋生物水母(Aequorea victoria)，gfp基因作为报告基因已被广泛地应用于丝状真菌生物学研究中。gfp基因通过与目标基因融合，可进行真菌的蛋白质及细胞器定位、细胞动力学、突变体致病力检测、生态学行为以及与其他生物互作等研究。

关键词绿色荧光蛋白(GFP)；丝状真菌；报告基因

中图分类号S 432.44；Q 816

绿色荧光蛋白(green fluoreseent protein，GFP)来源于海洋生物水母(Aequorea victoria)，由于其具有稳定、直观、操作方便的荧光性质和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等无可比拟的优点，以gfp基因作为报告基因已经广泛地应用于丝状真菌分子生物学研究中。玉米黑粉菌(Usti－lago maydis)是第一个成功应用GFP的丝状真菌，随后作为报告基因gfp应用于构巢曲霉(As-pergillus nidulans)和出芽短梗霉(Aureobasidi-um pullulans)。酵母是gfp基因在真菌中应用较多的真菌之一。目前，gfp已在12个属16个种的丝状真菌中表达，包括炭疽菌属(Colletotri—chum)、球腔菌属(Mycosphaerella)、大角间座壳属(Magnaporthe)、旋孢腔菌属(Cochliobo-lus)、木霉属(Trichoderma)、柄孢壳菌属(Podospora)、核盘菌属(Sclerotinia)、裂褶菌属(Schizophyllum)、曲霉属(Aspergil－lus)和疫霉属(Phytophthora)。本文对GFP发光特性、发光机制、应用特点及其在丝状真菌生物学方面的应用进行了回顾与展望。

1GFP的发光特性与机制

GFP是从水母分离出的一种天然荧光蛋白，由238个氨基酸残基组成的单链多肽，其荧光发射峰在509nm，最大激发波长为395nm，并在470nm处有一肩峰，GFP的化学性质相当稳定，其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6 mol/L盐酸胍处理。GFP的荧光发光机制尚不十分清楚，Morise等人曾提出一个能量传递模式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。Chattoaj等对GFP进行了光谱分析，结合前人工作提出GFP有两个明显的吸收带，对应于GFP的两种不同构象的基态A和B。基态A对应于395nm的吸收峰，基态B对应于475 nm的吸收峰，基态A占优势，基态B的分子数量约是基态A的1/6，两种基态间能缓慢地转换，但激发态A之间的转换很快且发生了质子转移，A快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过度态I，质子转移使A转变成I，I回迁到基态I时产生发射峰504nm的荧光，构象改变使I转变成B，由B到B发射荧光而不发生质子转移。目前，对于GFP的作用机理较为认同的仅仅是：GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。

2GFP的应用特点

GFP作为备受青睐的标记基因，在短短几年时间内便得以广泛应用，其原因在于它具有以下优点：

2.1易于检测、无毒害、可进行活细胞定时定位观察

GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代。对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的状态。通过GFP可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助于近来广泛使用的激光扫描共聚焦显微镜，结合强大的计算机软件，可进行三维显示。

2.2荧光稳定

GFP对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；GFP在pH7～12范围内也能正常发光；对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂等都有较强抗性。

2.3通用性

表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。

2.4易于构建载体

由于GFP分子量较小，仅为27～30ku，编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb，所以很方便地同其他序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。

2.5易于得到突变体

GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强了荧光强度，适合在不同物种中专性表达。

3GFP在丝状真菌研究中的应用

3.1 GFP作为报告基因

GFP作为报告基因所表现出的特性尤为突出。通过GFP可探测基因表达和蛋白定位，并可在单个生物体中持续显影成像，而用其他报告基因标记蛋白，只能短时间观察，并且每个数据点都来源于不同的个体。GFP体内探测不需要其他作用物，也不需要将其固定在某个组织上，因此，GFP成为人们深入了解转化以及基因表达的有效工具。此外，在所有的培养物中使用荧光计可轻松量化gfP基因表达，或使用共聚焦显微镜在单个细胞内、亚细胞成分内量化gfp基因表达。通过观察附着胞的形成过程，就可在共聚焦显微镜下观察到稻瘟病菌中EGFP1与钙调蛋白基因融合后的表达，这就表明CAMmg(稻瘟病菌钙调蛋白)的表达需要分生孢子表面附着。通过增加植物表面蜡的含量可以阻止附着胞的侵入。在稻瘟病菌中，将SGFP与mpg1基因的增强子融合在一起来研究真菌疏水蛋白的功能关系，研究发现分生孢子中的荧光蛋白并没有迁移到菌丝，表明mgp1的表达受到分生孢子生长的限制。在玉米真菌病原体中，SGFP与受碳源调节的Crg1增强子融合，用树胶醛糖诱导病菌使产生转化子，并且SGFP所发出的荧光不干扰Crg1的Northern印迹分析。为了证明在一些个体中，SGFP能够非常稳定的量化Crgl的表达，并且SG-FP很可聚集，因此要在其他的转化子中降低荧光量。编码多聚半乳糖醛内切酶的clpg2与SGFP融合，可在分生孢子萌芽以及形成附着孢的早期阶段用荧光显微镜观察，然后使用反转录PCR确定此基因表达的类型。

gfp基因表达后发生融合从而估测基因的表达和蛋白质定位也成功应用到真菌当中。玉米真菌病

原体的KIN2蛋白与SGFP融合产生一个功能融合蛋白，事实上融合蛋白中的GFP和其他蛋白的结构域都能同时发挥作用这就能够在不同的生理环境中准确的研究细胞中的蛋白。2008年，Soo Chan Lee等将GFP用于细胞定位方面的研究。通过构建参与泡囊组装以及运输的一类重要蛋白ArfA与sGFP的质粒来标记ArfA，在荧光显微镜下观察，ArfA定位在高尔基体内。并进一步用高尔基体运输抑制剂布雷菲(尔)德菌素处理，观察GFP后发现ArfA扩散到泡液中并堆积在亚细胞室内，表明ArfA定位并工作于高尔基体网络中。

GFP在体外致病基因表达中的研究也有应用，2005年，B.Clayton使用GFP作为ALS启动子活性的报告者，并通过流动细胞计数的方法度量所培养的白色念珠菌(Candida albicans)细胞中产生的荧光信号，使体外构建报告菌株研究ALS基因表达成为可能。

3.2 GFP在细胞动力学中的应用

GFP被广泛地用于丝状真菌细胞亚结构的研究，并具独特的效果。例如，丝状真菌的细胞核在生成后要运动很长一段距离才能到达菌丝顶端，经过用GFP标记了一个核定位信号的构巢曲霉，其细胞核区会发出明亮的荧光，从而可用于观察细胞核的迁移和孢子萌发过程中有丝分裂的情况。用此方法观察到了一些有趣的现象，例如同一菌丝中的细胞核并不是同时分裂，而是由顶端往下存在一个时间梯度，因此推测有丝分裂的时间差由一种可扩散的因子控制。最近Steid1等又报道了利用GFP对核定位进行研究的最新进展。构巢曲霉的Ua-pC蛋白是一种高亲和力、中等容量的尿酸黄嘌呤的运输载体，Valdez-Taubas等用UapC与GFP融合的方法，对细胞内吞作用的发生及液泡中溶酶体和内体的功能进行了有意义的探索。Golvesin是一种在盘基网柄菌属(Dictyostelium)细胞中与高尔基体膜及高尔基分泌小泡的膜有关的蛋白质，为了对高尔基体进行活细胞内的功能研究，Natalie等用GFP与Golvesin的C-末端及N-末端分别进行融合，并借助特异性抗体及其他标记来定位GFP与Golvesin融合蛋白，试验结果显示GFP融合或非GFP融合蛋白的定位相同，GFP堵塞C-末端会导致此蛋白滞留于高尔基体内，表明自由的C-末端是Golvesin从高尔基体转移到细胞其他部分所必需的，并且用此方法还精确地测算出高尔基体潴泡上的小管的伸出速率可达3～4μm/s。在有丝分裂过程中，融合蛋白一直保留在高尔基小泡中，因此可以观察到在胞质分割时高尔基体的解体与重建。

GFP还可以用来标记有丝分裂过程中的重要反应酶，从而研究此酶在有丝分裂过程中可能发挥的作用。利用GFP标记PLKA，进行活体监测明确了活体细胞中PLKA的超量表达与定位决定着PLKA的功能，PLKA的超量表达可以促使菌丝形成，但是阻碍细胞间期的核分裂。

3.3 GFP在突变体致病力检测中的应用

近年来，植物转基因技术取得了引人注目的成就。T-DNA和转座子作为植物基因的插入突变已广泛应用于基因的标签和分离中，从而成为发现新基因非常有效的手段。但是，在将转座子转进目标菌，筛选致病力增强或减弱菌株时却遇到了耗时量大，不易观察到微观侵染与扩展的难题，但gfp基因的应用解决了这一难题，人们可以将gfp基因转化受体菌，与野生型菌进行比较来直观观察菌株的致病力。2005年，Ben MBarek等(私人交流)将含有mimp1转座子的pNm1H181质粒和含有选择标记的pHE06质粒共转化小麦禾谷镰刀菌(Fusari-um graminearum)，可获得突变体，但突变体在进行鉴定时有一定困难，无法观察到在寄主体内的扩展状况，刘太国等(私人交流)再将含有gfp基因的质粒转化到含有以上两个质粒的受体菌中，获得了稳定转化GFP的转基因菌株，筛选出的突变体在致病性测定时可直接在荧光显微镜下观察菌丝的生长与扩展状况。

2007年，Iori Imazaki等将GFP应用到尖孢镰刀菌(F.oxysporum)菌株中，用来观察Fow2基因突变体菌株的致病性。将GFP转入F.oxyspo—rum的野生型菌株和突变体菌株中，进而在荧光显微镜下观察用GFP标记的野生型菌株和突变体菌株的侵染行为，发现突变体菌株丧失侵染根部并定殖植物组织的能力，从而得到无致病力突变菌株。

3.4 GFP在蛋白质表达中的应用

GFP在研究丝状真菌分泌型蛋白的过程中发挥了重要作用。黑曲霉(Aspergillus niger)用于生产异源蛋白质，但产量普遍低于产生同源蛋白质的菌株。尽管有证据表明丝状真菌蛋白的分泌机制与其他的真核细胞类似，即分泌蛋白集中在菌丝顶端，但却少有阐述。通过将sgfp整合到黑曲霉葡萄糖化酶的启动子区域，使得绿色荧光蛋白与葡萄糖化酶融合，第一次可以在单菌丝水平观察到黑曲霉体内葡萄糖化酶的分泌情况。

GFP技术成功地应用于葡糖糖化酶的定量以研究丝状真菌的菌丝形态对于蛋白分泌的影响。2005年，M.Talabardon等将载有pgpdAGLAGFP的质粒转化进黑曲霉，使得菌株能够编码GLA—GFP(葡糖糖化酶一绿色荧光蛋白)融合蛋白。用3种不同的培养方式得到载有pgpdAGLAGFP质粒的黑曲霉不同的菌丝形态(游离细胞培养、旋转纤维床、静态纤维床)，结果表明，融合蛋白的表达依赖于真菌的形态。

3.5GFP在真菌与其他生物间相互作用以及在真菌环境生态学中的应用

2004年，Lu Zexun等利用GFP标记技术研究了不同真菌间的相互作用。他们通过共聚焦扫描显微镜和荧光立体显微镜监测标记gfp的生防菌株木霉菌(Trichoderma atroviride)与土壤传播的植物病原物在共培养物或黄瓜种子上的互作，在原位水平上明确了两者的互作关系。真菌寄生菌丝沿着病原菌菌丝生长，然后卷曲，形成类似于钩状的特殊结构。

2008年，K.Rajasekaran等利用GFP标记技术研究真菌侵染棉花种子及定殖。将转入了绿色荧光蛋白标记的曲霉菌(菌株70)接种到棉花种子中，利用绿色荧光蛋白标记监测真菌的生长、侵染途径、定殖以及黄曲霉毒素的产生。分别测量接种后种子的重量，结果表明重量的减少值相似，即GFP标记菌株与野生型菌株在致病力上没有明显差别。同时利用菌株产生的绿色荧光[GFP发射的荧光强度是蓝绿黄(BGYF)荧光的10倍]能够鉴定、监测被黄曲霉菌侵占的特殊植物组织，在接种72h内就能观察到真菌侵占了内种皮和子叶。

4展望

目前，已经获得了酵母(Saccharomyces cerevi-

siae)的基因组全序列，而其他的一些丝状真菌的基因组，包括构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、链孢霉(Neurospora CraSSa)(http：//gene.genetics.uga.edu/)、异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostro—phus)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、疫霉菌(Phytophthora spp.)和稻瘟病菌(Magnaporthegrzsea)也已完成测序(http：//WWW.broad.mit.edu/annotation/fgi/)。那么这些真菌中每个基因的启动子的序列也都将被确定。随着微矩阵技术、数字图像技术、生物信息学技术的飞速发展和日趋完善，能够对亚细胞、单个细胞、整个有机体或单微矩阵的复杂荧光图片进行高通量的检测、储存和显示。因此，GFP技术与这些技术结合起来将对未来的真菌生物学产生深远影响。

目前，微矩阵技术可以同时分析一个环境的群体中上百个基因的表达，然而，这需要对有机物或特定组织在不同时间点进行RNA提取和cDNA的合成。对任何一个基因的功能分析都不仅包括何种环境因素刺激该基因表达，而且包括在哪种组织、哪个时间段产生及其产生的蛋白产物的亚细胞的位置和编码该基因表型的等位基因。以gfp为报告基因的转座子、启动子库、PCR为目的模块等解决了上述问题，且已在酵母和细菌中应用。真菌基因组学及改进的转化技术、高同源重组率、PCR和真菌转座子的鉴定使得已在细菌和酵母中成功应用的基因组研究在丝状真菌中成为可能，这些发展可以大量地进行真菌基因功能分析，而对于许多丝状真菌，低转化率制约了这一途径。

在复杂环境中能够高通量筛选大量通过基因组方法产生的突变真菌是从未遇到的挑战。在细菌系统中，Sternberg等发明了一种决定细菌在通流室分布和生长的技术，该技术将编码不稳定的GFP蛋白的gfp基因与rRNA融合，从而可以实时观测细菌在复杂菌落中的生长和分布，这种发明也可以应用到真菌系统中。许多研究人员利用GFP标记的真菌来研究真菌在自然系统中的分布，改造真菌所在的复杂环境，无论是在实验室或是封闭的温室内，仍存在一些挑战。由于许多丝状真菌可以产生大量的易于扩散的孢子，且这些孢子在空气中易于积累到高浓度，因此操作这些基因改造过的真菌需在封闭的环境内，这些微生物进入环境所带来的生态影响尚需评估，特别是那些未知的选择基因必须要慎重考虑。虽然自转化生物中消除选择标记的技术已经成熟，但尚缺乏关于转化真菌释放到环境中真菌相关的适合度、病害流行学及可能引起的生态影响的研究。目前美国农业部已经同意释放基因改造过的真菌，关于释放的条件及其相关的环境评估报告可在相关网址http：//www.nbiap.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm中找到。

总之，在获取大量真菌基因组信息的同时，GFP也在分子工程改造、荧光探测和图像分析上取得了相当大的发展，综合利用这些技术和信息会给真菌生物学带来光明的前景。