小麦胚芽鞘体细胞染色体制片技术初探

姚占军　王嘉瑞　蔺瑞明　冯　晶　徐世昌

摘要本试验对小麦胚芽鞘体细胞染色体制片技术进行了初步探索。结果表明，利用小麦胚芽鞘细胞可以获得理想的染色体制片，而且具有切取胚芽鞘对小麦个体植株伤害小，胚芽鞘体积大、分裂相多，易于制片，镜下观察染色体较大，杂质少，背景清晰等特点，可满足染色体核型分析和染色体分带的技术要求。初步建立起以小麦胚芽鞘为取样对象的体细胞染色体制片方法。

关键词小麦；胚芽鞘；染色体制片

中图分类号Q 942

普通小麦通过远缘杂交等手段获得外源染色体(质)后，会导致个体的表型、染色体组成和结构特征等多方面的改变，表现为分离大、类型多、稳定慢的特点。无论是转移外源基因还是应用外源基因，都需要对外源染色质进行可靠、有效的检测，因此对外源染色体(质)的检测贯穿了小麦远缘杂交的整个过程。外源染色体(质)检测的基本手段是细胞学检测。细胞学检测基础是染色体制片技术，而影响制片的因素很多，其中最基础的环节就是取材。传统的取材对象是小麦初生根的根尖(生长点)。由于小麦初生根数量有限，且对小麦个体损伤较大，因此谋求新的取材对象很有必要。

禾谷类作物种子萌发有3个阶段，即种子吸胀、细胞分裂、芽鞘的伸长。以往研究认为成熟小麦种子中胚芽鞘已经分化完毕，胚芽鞘伸长过程实质是后期的细胞扩大，而没有细胞分裂参与。对此邹琦等曾解释，胚芽鞘细胞在胚中已分化完成，一旦开始生长便不再进行细胞分裂增殖，胚芽鞘的生长仅是细胞伸长，认为胚芽鞘伸长与膨压有关，膨压增加提供了胚芽鞘伸长延伸的动力。然而，陆长梅等在国内首次报道了在黄化小麦(Triticum aestivumL.)胚芽鞘中发现了正在分裂的细胞，这一发现为小麦胚芽鞘细胞学行为研究提供了新信息。迄今为止，国内尚未见到针对小麦胚芽鞘细胞染色体制片技术的相关报道。为此，本试验以小麦胚芽鞘为取材对象，开展了体细胞染色体制片技术的探索，旨在为细胞学研究提供新技术。

1材料与方法

1.1小麦材料

小麦材料为中国春ph1b与中4杂交选育出的小麦抗条锈病品系P58-2，由中国农业科学院植物保护研究所条锈组提供。

1.2试剂

(1)卡诺固定液V(无水乙醇)：V(冰醋酸)=3：1；(2)0.1mol/LHC1；(3)45％冰醋酸；(4)染色液：改良苯酚品红染液。

1.3小麦胚芽鞘细胞制片

染色体制片采用常规的压片技术结合去壁低渗火焰干燥技术，并加以改进。

1.3.1小麦种子萌发

室温或恒温箱(25℃)浸泡若干P58—2种子至露白(胚根鞘突破种皮，图1a)，置于垫有湿滤纸的培养皿内，于4℃下处理24～48h后，再移到室温或恒温箱(25℃)培养。

1.3.2预处理

待胚芽鞘长到种子长度一半至全长时进行离体预处理。取材时间在09:00～11:00，用刀片剥开胚芽鞘(刀片垂直于胚芽鞘)，用镊子轻轻捏住胚芽鞘基部上提，取下胚芽鞘置于冰水混合物中，在4℃冰箱内进行预处理12～24h。

1.3.3固定和保存

将预处理后的胚芽鞘用卡诺氏固定液在4℃冰箱中固定12～24h，转保存于70％乙醇中备用(-20℃冰箱长期存放)。

1.3.4解离和染色

将固定好的胚芽鞘用蒸馏水清洗20～30min，用滤纸吸干胚芽鞘上的浮水，浸于在60℃的水浴锅中预热的1mol/L HC1，解离3～5min(因材料、季节而异)去细胞壁，取出用蒸馏水清洗15～20min；取适量材料用45％冰醋酸直接压片，火焰干燥后，相差显微镜下观察；或用改良卡宝品红染色15～20min，取适量材料用45％冰醋酸压片，普通光学显微镜下观察。

2结果与讨论

通过与小麦传统的根尖体细胞制片相比，观察发现胚芽鞘体细胞制片也是行之有效的，而且具有如下特点：(1)切取胚芽鞘对小麦个体植株伤害小。传统取材对象是小麦初生根根尖(生长点)，而种子萌发到离乳期之前，初生根在吸收水分和无机盐等方面作用明显，一旦截取将严重影响小麦幼苗生长；胚芽鞘是作物子叶应对生长初期逆境的保护组织，自然条件下胚芽鞘见光后即停止生长，由于胚芽鞘存在时间短，功能相对简单，营养消耗小，因此胚芽鞘剥离后胚芽仍可生长，且对小麦个体植株生长伤害相对较小(图1)。(2)胚芽鞘体积大、分裂相多，便于取材。在小麦种子发芽过程中，整个胚都要萌动即都有分裂相。虽然胚根生长先于胚芽包括胚芽鞘，但胚芽鞘生长速度会越来越快。传统的根尖取材时问是当根尖长到0.5～1.5cm时取材，这时胚芽鞘也长到接近种子的长度或稍短，此时胚芽鞘的体积要远远大于小麦3条初生根根尖体积的总和，胚芽鞘内处于分裂状态的细胞总数多于根尖，更利于小麦细胞学检测。(3)胚芽鞘体细胞更易于制片。自然条件下，根需要不断下扎，由于根尖细胞长期的进化，使其木质化程度提高。而胚芽鞘是一片不完全叶，胚芽鞘细胞木质化程度相对较低，故而HC1水解或混酶(果胶酶、纤维素酶和解离酶)解离细胞壁处理时间相应缩短，较根尖细胞解离时间缩短一半。因此，胚芽鞘细胞制片操作方便快捷，染色体易分散，更容易获得良好制片。(4)与传统的根尖体细胞染色体制片相比，胚芽鞘体细胞镜下观察染色体较大，杂质少，背景清晰，更适于染色体核型分析和染色体分带(图2)的技术要求。

控制预处理时间。预处理是染色体制片技术的关键环节。普通小麦通过远缘或近缘杂交后代分离出的类型很多，种子发芽势亦有不同。因此，预处理时间应根据材料的不同而异，一般预处理时间为24～72h。试验中发现，种子萌发倾向于普通小麦的程度越大，预处理时间应越短，但不能少于24h；反之，种子萌发倾向于远缘或近缘物种的程度越大，预处理时间应越长，但不要超过72h。对于具体的某一小麦材料，若要确定其预处理时间，可设不同时间梯度确定。

控制HC1水解处理时间。HC1能解离细胞壁之间的果胶物质及部分细胞质。由于HC1直接作用于胚芽鞘细胞壁，解离充分与否直接关系到制片的好坏。解离不充分，制片时细胞不易分散，染色体集中成团；解离过于充分，制片时细胞易破碎，染色体易断裂，得不到好的制片。本试验将固定好的胚芽鞘用蒸馏水清洗20～30min，放入1mol/LHC1中在60℃水浴锅中解离3～5min，获得较为理想的解离效果。但因处理材料、季节以及水浴锅精确度等因素而异，应设不同时间梯度来确定各自的解离时间。

小麦胚芽鞘取材过程中要尽量减少对萌发种子的损伤，应做到稳、准、狠。(1)已萌发种子各器官都比较脆弱，特别是胚芽易折断，取材时下手一定要稳；(2)胚芽鞘紧贴子叶，取材时下手一定要准，以免伤到子叶；(3)胚芽鞘取材下手一定要狠，即取材要干脆利落，缩短操作时间；(4)取材时间在09:00～11:00，因为这段时间细胞分裂最旺盛。

3结论

研究表明利用小麦胚芽鞘细胞可以获得理想的染色体制片，并初步建立起以小麦胚芽鞘为取样对象的体细胞染色体制片方法。该方法具体操作步骤为：(1)在25℃恒温箱内浸泡小麦种子至露白，置于垫有湿润滤纸的培养皿内于4℃下处理24～48h，再转到24～25℃下发芽；(2)待胚芽鞘长到种子长度一半至全长时，于09:00～11:00取样，置冰水混合物中预处理12～24h，再用卡诺固定液固定12～24h后，保存于70％乙醇中备用；(3)固定好的材料用蒸馏水清洗20～30 min，滤纸吸干覆水，放入1mol/L HC1中置于60℃水浴锅解离3～5min，自来水清洗15～20min；(4)取适量材料用45％冰醋酸直接压片，火焰干燥后，相差显微镜下观察；或用改良卡宝品红染色15～20min，取适量材料用45％冰醋酸压片，普通光学显微镜下观察。