一株银杏内生真菌代谢产物抗菌活性初步研究

申屠旭萍　俞晓平　夏湛恩　徐红星

摘要从浙江长兴采集的银杏茎中分离到一株内生真菌，编号为1028。本文对其产生的代谢产物进行了抑菌活性的初步研究，生测结果表明：离体条件下发酵液对番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、葡萄炭疽病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜立枯病菌均有较强的抑制作用，对不同病原菌的抑制率分别为：66．7％、48．3％、64．6％、36．5％、57．1％、23．0％。抑菌活性成分在80℃以下趋于稳定，pH为7～8时抑菌效果最强。

关键词内生真菌；银杏；抑菌活性

中图分类号S 435．131．49

植物内生真菌(plant endophyticfungi)是一种新兴的微生物资源，研究表明其对植物某些活性成分的形成有重要影响，通常会产生与其宿主植物相同或相似的生理活性物质。近年来，植物内生真菌本身及其次生代谢产物应用于医药和农业方面的研究逐渐成为热点。而从银杏中分离筛选内生真菌，其液体发酵产物用于抑制植物真菌病害病原菌的研究国内外未见报道。本文从浙江长兴采集的银杏茎中分离筛选到一株内生真菌，并进行其代谢产物对多种植物真菌病害病原菌的抑制作用的研究；同时也测定了活性成分在不同条件下抗菌效果的稳定性，以便为该菌株的进一步开发利用提供理论和实践基础。

1材料与方法

1．1供试菌株及来源

从浙江长兴银杏长廊采集的银杏茎中分离筛选到一株内生真菌，编号为1028，接种于试管斜面培养基，4℃保存。

供试病原菌：番茄早疫病菌(Alternaria sola—ni)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium ox ysporum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、葡萄炭疽病菌(C．gloeos porioides)、水稻纹枯病菌(Thanate phoruscucumeris)和黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)，由浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所提供，斜面保藏于4℃冰箱中，备用。

1．2培养基

斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼旨20g，水1 000mL,pH自然。马钤薯去皮，切成块煮沸0．5h，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1 000mL。

发酵培养基：黄豆饼粉10g，玉米粉7．5g，可溶性淀粉10g，麸皮5 g，蛋白胨4g，CaCO³2．5g，Nh⁴NO³1．5g,MgSO⁴0．5g，KH²PO⁴1．5g，水500mL。

1．3内生真菌发酵

将500mi。培养液分装在300mL。的三角瓶中，每瓶装液量为50mL。用接种钩挑取少许No．1028菌丝接种于培养瓶中，置于27℃摇床，200 r／min，振荡培养4d。发酵液5 000r／min离心8min，取上清液，弃菌丝体。

1．4发酵液抑菌活性测定

取No．1028菌株发酵液1mL。于无菌培养皿内，与9mL。冷却至45℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面放1个供试菌的菌饼(直径为4mm)，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9 cm)，置28℃培养，以无菌水处理作为对照，重复3次。其中，番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、葡萄炭疽病菌培养72h，水稻纹枯病菌和黄瓜立枯病菌培养18h，采用十字交叉法测定菌落直径，计算抑制率。

1．5发酵液稳定性的测定

1．5．1热稳定性

取3mL．No．1028菌株发酵液于50、60、70、80、90、100℃水浴锅中分别处理2h，以未处理的发酵液做对照，重复3次。参照1．4方法测定菌丝生长直径，根据直径大小计算菌丝生长抑制率，并确定其热稳定性。

1．5．2酸碱稳定性

分别取3 ml．No．1028菌株发酵液加入5支无菌试管中，用6 mol／L HCl和2 mol／I．NaOH分别调至pH为3、5、9、11，放置2h，做抑菌试验，以未处理的发酵液(自然pH6．8)做对照，重复3次。参照1．4方法测定菌丝生长直径，计算抑制率。

2结果与分析

2．1菌株发酵液对植物病原菌的抑制作用

从表1可以看出No，1028菌株发酵液对6种植物病原菌均有不同程度的抑制作用。其中对番茄早疫病菌、菜豆炭疽病菌、水稻纹枯病菌的抑制率都在50％以上，而对黄瓜枯萎病菌的抑制率在48％左右，对葡萄炭疽病菌、黄瓜立枯病菌的抑制率则分别在36％和23％。试验结果可以说明No．1028发酵液抗菌谱较广，抗菌效果较好。

2．2温度对No．1028发酵液抑菌作用的影响

以黄瓜立枯病菌和水稻纹枯病菌为指示菌，测定不同温度下No．1028内生真菌发酵液的抑菌活性。结果见图1(以未处理的发酵液的抑菌效果为100％，其他温度下处理后的抑菌效果与其相比较所得百分比为相对抑制效果)。由图1可知，No．1028菌发酵液经不同温度处理后其抑菌效果有一定的差别。当温度超过80℃以上时对活性成分的稳定性影响较大，抑菌效果变差，可能发生分解现象；处理温度在40—70℃之间时，抑菌效果稍有减弱，但不明显。这表明No．1028内生真菌发酵液中的抑菌活性成分在80℃以下具有较好的热稳定性。

2．3pH对No．1028发酵液抑菌作用的影响

同样以黄瓜立枯病菌和水稻纹枯病菌为指示菌，研究pH对No．1028内生真菌发酵液抑菌活性的影响。结果见图2(以发酵液自然pH的抑菌效果为100％，其他pH下处理后的抑菌效果与其相比较所得百分比为相对抑制效果)。在pH7—8，发酵液对黄瓜立枯病菌和水稻纹枯病菌的抑制效果相对较强。pH升高或降低对抑制效果有一定的影响，尤其是pH升至ll时，抑菌效果下降十分明显。

3结论

通过本试验，明确了银杏内生真菌No．1028对6种植物病原菌有不同程度的抑制作用，说明银杏内生真菌No．1028代谢产物是一个很有发展前景的抑菌活性物质；同时测定了No．1028发酵液在加热、酸碱处理条件下的稳定性，发现活性成分在80℃以下趋于稳定，pH为7～8时抑菌效果最强。通过此项研究，为此菌株的进一步研究和产品开发奠定了坚实的基础。

目前，研究工作正处于No．1028内生真菌发酵液中活性成分提纯和结构论证阶段，关于活性化合物的提取分离研究将在另文发表。