柑橘鳞皮病研究进展

吕婵娟　周常勇

摘要柑橘鳞皮病是一种分布在包括南美洲和地中海等广大地区的重要病毒性病害，随着大量国外优良柑橘品种的引进，增加了柑橘鳞皮病随同苗木、接穗传入我国的可能性。本文对柑橘鳞皮病的类型、研究历史、病原、传播方式、检测技术以及防治方法作一综述，为今后我国对柑橘鳞皮病的检疫和防治研究提供基础。

关键词柑橘鳞皮病；鳞皮病A；鳞皮病B；检测技术

中图分类号S 435．131．49

柑橘鳞皮病是由柑橘鳞皮病毒(Citrus Psorosis CPV)引起的一种病毒性病害，主要分布在美洲和地中海等地区的国家，造成了十分严重的危害。随着对该病害研究的深入特别是分子检测技术的发展，国外对柑橘鳞皮病有了较为全面的认识，然而我国在柑橘鳞皮病方面尚缺乏系统研究。鉴于目前我国大量引进国外优良柑橘品种，增大了柑橘鳞皮病传人我国的可能，因此对鳞皮病应予以较全面研究。本文就目前国内外柑橘鳞皮病的研究进行综述。

1鳞皮病的类型

一般认为鳞皮病有鳞皮病A和B两种类型。鳞皮病B也被称为环斑病(ringspot)。基于具有相同或相似的嫩叶症状，囊胶病(concave gum)、鸡冠皮病(cristacortis)和石果病(impietratura)被认为与鳞皮病属于同一类群，但它们的病原性质还没有确定；柑橘皱叶病(citrus crinkly leaf)、柑橘杂色花叶病(citrusvaregation)亦曾和鳞皮病归于同一类群，但后来实验证明，它们是另外的病毒引起的。

2病害的历史

Swingle和Webber最早于1896年在佛罗里达观察到柑橘鳞皮病症状，但当时并不了解其病因。Fawcett观察到柑橘嫩叶出现花叶并伴随树皮鳞片的症状是由一种病毒引起的，并将该病毒命名为CPV。Wallace等发现了另一种鳞皮病症状，并将引起这种症状的病毒命名为柑橘环斑病毒(Citrusringspot virus，CRSV)。CPV和CRSV在叶片和树皮上表现类似的症状，但各自的严重程度不同，过去常被视为不同的病害，但现在已被视为同一种病害。

Wallace报道鳞皮病A和鳞皮病B间具有交叉保护作用，即在感染了鳞皮病A的植株上接种鳞皮病B，症状会明显减轻。

3病原

CPV属于新成立的蛇形病毒属(Ophiovirus)，病毒粒子具有裸露的线形核衣壳，直径约3 nm，可形成卷曲的环(内部可能有盘绕)。Derrick等报道该病毒粒子包含了T、B两个组分，其中T组分的长度为300～500nm，B组分为1 500～2 500nm，它们能在不同的蔗糖浓度梯度下被分离，能编码包含48kD的衣壳蛋白(CP)，只有这两部分同时存在时病毒才具有侵染性。随后的研究表明CPV至少包含3个组分，即T1RNA、T2RNA和BRNA，基因组总长11～12kb，分别为1．6～1．8kb、1，5kb、7．5—9．0kb。T1RNA包含一个ORF，编码由476个氨基酸组成的分子量约54kD的衣壳蛋白；T2RNA包含一个ORF，编码含436个氨基酸、分子量约49kD的衣壳蛋白；BRNA则包含两个ORF，分别编码280kD和24kD的衣壳蛋白。

4寄主范围和症状

柑橘鳞皮病主要危害甜橙、宽皮柑橘和葡萄柚等。鳞皮病A引起寄主主干和大枝树皮呈鳞片状开裂，木质部充胶变色，春、秋梢嫩叶呈现橡形叶症状以及沿叶脉褪绿斑纹，少数春梢会表现较轻的休克症状，随叶片老化后症状消失；鳞皮病B引起老叶亦显环斑症状，果实呈现环形凹陷斑，树皮症状蔓延快，小枝上呈现木栓化，隆起的浸胶斑点。另外有报道在加利福尼亚和南美洲等一些地方，一些被柑橘鳞皮病侵染后的植株并不表现症状。

5病害传播

鳞皮病除嫁接传播外，还可通过机械方法从柑橘向柑橘或草本植物传播。Campiglia等报道，在乌拉圭的250株枳橙上有1％表现了鳞皮病症状，从而表明鳞皮病可以通过种子进行传播。另外，Levy等报道CPV可通过微内藏菟丝子(Campestrissubinclusa)在柑橘与草本植物间进行传播。柑橘鳞皮病在阿根廷、乌拉圭、印度等国家的自然传播仍然未完全得到证实，但在阿根廷，蚜虫是可能的潜在自然介体。

6防治方法

通过指示植物鉴定，茎尖嫁接脱毒或热处理获得无鳞皮病母树，培育无病苗木可以有效防治此病。由于囊胶病可以通过枳和枳橙的种子传播，砧木种子、母树也需要通过鉴定无病方可使用。

7检测方法和技术

7．1指示植物鉴定

Wallace首次用柑橘苗作为指示植物鉴定鳞皮病A。常用的木本指示植物有邓肯葡萄柚、墨西哥来檬、甜橙和香橼等。其中，甜橙是最佳的指示植物，症状主要表现为新生叶片褪绿斑驳，呈黄色的环斑和污斑，明脉和叶脉环阻等；常用的草本指示植物有昆诺藜、美丽菜豆、黑眼豇豆等，症状表现为接种叶上产生局部坏死枯斑。研究表明，木本指示植物接种后的前28d对症状的表现至关重要，低温更容易促进症状的表现，如鳞皮病A在白天最高温度24—27℃，夜间最低温度18～21℃时症状表现最为明显。

7．2血清学鉴定

Clark等利用双抗体夹心ELISA法(DAS-ELISA)，随后又运用三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)法对CPV进行检测。在意大利，人们利用DAS-ELISE和TAS-ELISE对田间苗圃进行CPV的实测。Garcia等制备了多种CPV的多克隆和单克隆抗体，并使用来自佛罗里达的CtRSV-4的抗血清对美国、阿根廷、西班牙、意大利的20个不同的CPV株系进行检测，结果表明，该方法可以检测出大部分株系。但由于该病毒存在多个株系和血清型，所以血清学的方法均不能同时检测鳞皮病的所有株系。130nghia等用直接组织点免疫法(DTBIA)对CPV进行了检测。

7．3分子杂交

Barthe等发展了基于CPV衣壳蛋白基因(CPG)的分子杂交检测技术，利用32P-CDN探针检测出来自加利福尼亚的CPV-4和CPV-6等株系。Martin等，在其基础上利用探针检测出柑橘环斑病株系P-121。

7．4PCR检测方法

Garcia等对CtRSV-4的cDNA片段进行克隆和测序，并由此设计了一对引物用于检测柑橘鳞皮病的CtRSV-4、CpSAV90—1—1和其他4个来自美国和阿根廷的柑橘鳞皮病分离株。Legarreta根据T1RNA和BRNA的部分序列设计出了两对引物，结果TI—引物能检测出23个来自阿根廷、美国自西班牙和意大利的分离株。同年，Barthe等克隆了CPV的CPGESJ，并发展了基于CPG序列的PCR检测方法，分别扩增出了600 bp的部分CPG序列和1 317bp完整的CPG。随后Legarreta等又在常规PCR的基础上发展了半巢式RT-PCR，根据CPV的RNAl设计了一对半引物对来自阿根廷的6个株系进行检测，结果表明这6个株系具有很高的同源性，这种方法与常规PCR相比具有更高的灵敏度。最近，Martin等根据CPV的RNA3设计了一对引物，建立了一步法RT-PCR，大大缩短了PCR的时间。

综上所述，国外对柑橘鳞皮病的研究起步早，现对柑橘鳞皮病的发生和检测技术的研究已比较成熟，而国内除中国农业科学院柑橘研究所病毒组应用指示植物鉴定该病害外，尚未涉及该病害的分子检测研究。鉴于该病害的危险性以及植物检疫工作快速检测的需要，加强对柑橘鳞皮病的研究，建立一套快速、准确的分子生物学检测技术，对我国柑橘优良品种的引进和推广安全，防止柑橘鳞皮病在我国的进一步扩散，确保我国农业生产安全和对外贸易的顺利进行等方面具有重要意义。